Mundarija

GPM.1.7.2.0022.15 Western blot usuli yordamida immunobiologik dori vositalarining haqiqiyligi va tozaligini aniqlash

UMUMIY FARMAKOPOE MAQOLASI

Birinchi marta taqdim etilgan

Ushbu umumiy farmakopeya monografiyasi immunoblottingning variantlaridan biri bo'lgan Western blot usuliga tegishli bo'lib, u yuqori darajada tozalangan oqsillar, shu jumladan rekombinant DNK texnologiyasidan foydalangan holda olingan immunobiologik dori vositalarining (IMP) haqiqiyligi va tozaligini baholash uchun qo'llaniladi.

Birinchi bosqichda oqsillarni ajratish uchun natriy dodesil sulfat (SDS-PAGE elektroforezi deb ataladigan) bilan poliakrilamid jelida elektroforez amalga oshiriladi. Keyin oqsillar nitrotsellyuloza membranasiga yoki PVDF membranasiga o'tkaziladi. Aniqlash ishqoriy fosfataza yoki xren peroksidaza (ELISA ning to'g'ridan-to'g'ri versiyasi) bilan konjugatsiyalangan oqsilga xos bo'lgan antikorlar yoki ketma-ket aniqlanayotgan oqsilga birinchi antikorlar va ikkinchi antikorlar (antiglobulin zardobi deb ataladigan) yordamida amalga oshiriladi. ), ishqoriy fosfataza yoki horseradish peroksidaza (ELISA ning bilvosita versiyasi) bilan konjugatsiyalangan immunoglobulinga xos bo'lgan birinchi antikorlar.

Ushbu OFS hozirgi vaqtda eng keng tarqalgan usullardan biri sifatida rang reaktsiyasiga asoslangan aniqlash usulini tavsiflaydi. Aniqlash uchun xemiluminesans usullari, jumladan, kuchaytirilgan kimiluminesans va radioaktiv yoki lyuminestsent teglar (RIA yoki RIF) usullaridan ham foydalanish mumkin.

Sinov farmatsevtik moddalar yoki tayyor mahsulotlar bilan amalga oshiriladi.

Haqiqiylikni baholashda, elektroforez bosqichida, sinovdan o'tgan namunalarga qo'shimcha ravishda, jel quduqlariga quyidagi eritmalar qo'shilishi kerak: salbiy nazorat namunasi (1 marta namuna tayyorlash buferi), molekulyar og'irlik belgilarining aralashmasi (qo'llash oldindan bo'yalgan molekulyar og'irlik belgilari tavsiya etiladi), sinovdan o'tkazilayotgan oqsilning standart namunasi (agar mavjud bo'lsa), belgilangan tartibda sertifikatlangan. Tozalikni (ifloslanishlarni) baholashda aralashmani aniqlash yoki miqdoriy aniqlash chegarasiga (usulning maqsadiga qarab) mos keladigan va usul natijalariga ko'ra belgilanadigan oqsil konsentratsiyasiga ega namunani qo'shish uchun qo'shimcha shartlar qo'yilishi kerak. tasdiqlash. Tozalikni baholashda blot natijalarini poliakrilamid gel elektroforez natijalari bilan solishtirish kerak; texnika 1% nopoklikni aniqlashi kerak.

Metodologiya

Oqsillarni molekulyar og'irliklari bo'yicha ajratish uchun elektroforez birinchi navbatda "Poliakrilamid jellarida elektroforez" umumiy farmakopeya monografiyasida ko'rsatilgan protseduraga muvofiq amalga oshiriladi.

Proteinni uzatishni amalga oshirish uchun oqsilni uzatish moslamasi ishlatiladi. Barcha ishlar rezina qo'lqop yordamida amalga oshiriladi. Amaldagi barcha eritmalarning hajmi oqsillar o'tkaziladigan membranani to'liq botirish uchun etarli bo'lishi kerak.

Jelni immunoblottingga tayyorlash uchun elektroforezdan so'ng u oqsillarni o'tkazish uchun bufer eritmasi bilan to'ldiriladi (agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa), orbital shakerga joylashtiriladi va 10-15 daqiqa davomida saqlanadi. Keyin jelning o'lchamiga mos keladigan nitroselüloz yoki PVDF membranasi tayyorlanadi. Nitrotsellyuloza membranasini qo'llashda varaq 5 daqiqa davomida deionizatsiyalangan suvda, so'ngra oqsillarni o'tkazish uchun bufer eritmasida 5 daqiqa davomida saqlanadi (agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa). PVDF membranasini qo'llashda uni metanol yoki spirt eritmasida 10-15 daqiqa ushlab turish kerak, so'ngra nitroselüloz membranasi bilan bir xil amallarni bajarish kerak.

Proteinlarni nitroselüloza yoki PVDF membranasiga o'tkazish uchun "sendvich" yig'iladi. Buning uchun oqsilni uzatish moslamasiga kiritilgan maxsus shimgich oqsil o'tkazuvchi bufer eritmasi bilan namlanadi va maxsus plastik ramkaga joylashtiriladi, uning ustiga bir-uch varaq filtr qog'ozi (masalan, Whatman 3MM) mos ravishda kesiladi. membrananing kattaligi va transfer eritmasiga namlangan oqsillar. Yuqoriga jel qo'yiladi, uning yuzasiga nitroselüloza yoki PVDF membranasining tayyorlangan varag'i ehtiyotkorlik bilan (havo pufakchalarisiz) joylashtiriladi. Protein o'tkazuvchi eritmada oldindan namlangan bir varaqdan uch varaqgacha filtr qog'ozi membranaga joylashtiriladi va ustiga oqsil o'tkazuvchan eritmasiga namlangan ikkinchi maxsus shimgich bilan qoplanadi. Ramka qisqichlar bilan mahkamlanadi va asta-sekin oqsil o'tkazuvchi eritma bilan to'ldirilgan elektroforez qurilmasiga botiriladi, membrana varag'i anodga qaragan. Qurilmani yoqing. Proteinlarni elektroforetik o'tkazish xona haroratida 25 daqiqa davomida amalga oshiriladi, oqim chegarasi A max = 2 mA / sm 2 tezligida (masalan, 10 × 10 sm 2 A max = 200 mA o'lchamdagi jel uchun), farmakopeya maqolasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa.

Proteinlarni jeldan membranaga yarim quruq o'tkazish uchun uskunadan foydalanish bo'yicha ko'rsatmalarga muvofiq foydalanishga ruxsat beriladi.

O'tkazish tugagandan so'ng, "sendvich" demontaj qilinadi. Membrana fosfat-buferli tuz (PBS) bilan yuviladi.

Proteinni uzatishning to'liqligi rangli molekulyar og'irlik belgilarini o'tkazish orqali vizual tarzda baholanadi, ularning barcha asosiy oqsil bantlari membranada aniqlanishi kerak.

Aniqlash

Western blot usuli natijalarini aniqlash uchun sinov preparati antikorlar bilan ishlov beriladi (gibridlanadi). Buning uchun oqsillar o'tkazilgan membrana blokirovka qiluvchi bufer eritmasi bo'lgan idishga joylashtiriladi va 30-60 daqiqa davomida orbital shakerda inkubatsiya qilinadi (agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha qoida nazarda tutilgan bo'lmasa) o'ziga xos bo'lmagan sorbsiyani oldini olish uchun. membranada antikorlar.

Shundan so'ng, agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha qoida nazarda tutilgan bo'lmasa, membranani yuvish tampon eritmasida 5 daqiqa davomida uch marta yuving.

Keyin membrana tahlil qilinayotgan oqsilga birinchi antikorlarning eritmasi bilan ishlov beriladi, antikorlar uchun bufer eritmasi yordamida tayyorlanadi (agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa) foydalanish bo'yicha ko'rsatmalarga muvofiq darhol foydalanishdan oldin. Antikorlarni davolash xona haroratida 30-60 daqiqa davomida amalga oshiriladi (agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa).

Keyinchalik, farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, membrana xona haroratida orbital shakerda bog'lanmagan antikorlarni olib tashlash uchun bufer eritmasi bilan 5 daqiqa davomida uch marta yuviladi.

Membranani yuvgandan so'ng, ikkinchi antikorlar eritmasi bilan davolash (gibridizatsiya) amalga oshiriladi. Birinchi antikorlarni olish uchun ishlatilgan hayvon turlarining immunoglobulinlariga poliklonal antikorlar ikkinchi antikor sifatida ishlatiladi. Ushbu antikorlar fermentga (horseradish peroksidaza yoki gidroksidi fosfataza) konjugatsiya qilinadi. Ushbu bosqichni bajarish uchun birinchi antikor eritmasini ikkinchi antikor eritmasi bilan almashtirib, yuqorida tavsiflangan protsedurani takrorlang. Keyin membrana bog'lanmagan ikkinchi antikorlardan birinchisiga o'xshash tarzda yuviladi.

Membranada immunoblot naqshini ishlab chiqish xren peroksidaza bilan konjugatsiyalangan antikorlar uchun tetrametilbenzidin substratining (TMB) eritmasi yoki gidroksidi fosfataza rivojlanishi uchun eritma bilan - ishqoriy fosfataza bilan konjugatsiyalangan antikorlardan foydalanganda (agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa) amalga oshiriladi. farmakopeya monografiyasi yoki me'yoriy hujjatlar).

Reaksiya dog'ni deionizatsiyalangan suv bilan yuvish orqali to'xtatiladi. Ortiqcha suv membrana yuzasidan filtr qog'ozi bilan chiqariladi va qorong'i joyda havoda quritiladi.

Natijalarni baholash

Haqiqiylikni baholashda ishlab chiqilgan membranadagi asosiy rangli chiziqlar elektroferogrammadagi asosiy rangli chiziqlarga mos kelishi kerak.

Tahlil qilinayotgan moddaning miqdori va aralashmalarning tarkibi, shuningdek ularning nisbati densimetrik tarzda baholanadi.

Tizimga moslik mezonlari

Western blot usulining natijalarini hisobga olish mumkin, agar:

• molekulyar og'irlik belgilari mos keladigan jel yo'lining butun uzunligi bo'ylab teng ravishda taqsimlanadi;
• dog'da jel Coomassie yorqin ko'k R-250 yoki G-250 bilan bo'yalganida aniqlangan barcha asosiy chiziqlar ko'rsatilgan;
• farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda belgilangan minimal konsentratsiyali namuna aniqlanadi

Natijalarni qabul qilish mezonlari

• Sinov namunasi dog'ini mos yozuvlar namunasi bilan moslashtirish, masalan, tozalangan oqsil (modda) asosidagi tegishli standart namuna;
• asosiy aniqlangan komponentning molekulyar og'irligining spetsifikatsiya talablariga muvofiqligi;
• standart namunadagi aniqlangan aralashmalar tarkibining standart namuna uchun sertifikatda belgilangan diapazonga muvofiqligi.

Identifikatsiya va soflikning Western blot testi nopoklikning o'ziga xosligi va aniqlash chegarasi uchun tasdiqlangan tasdiqlash xususiyatlariga ega bo'lishi kerak.

Usulni tekshirishning xususiyatlari

Haqiqiylikni baholash uchun metodologiyadan foydalanganda natijalarning maqbulligi mezonlarini asoslash kerak; Belgilangan tartibda sertifikatlangan tozalangan oqsilga asoslangan standart namunadan foydalanish tavsiya etiladi.

Tozalikni baholash usulidan foydalanganda, nopoklikni aniqlash chegarasini asoslash kerak. Miqdoriy aniqlashda nopoklikni miqdoriy aniqlash chegarasini asoslash, asosiy komponent va aralashmalarni aniqlashda chiziqli diapazonni, usulning aniqligi va to'g'riligini ko'rsatish kerak. Shu maqsadda tozalangan oqsilga asoslangan standart namunadan foydalanish maqsadga muvofiqdir. Farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda ko'rsatilgan usulga o'zgartirishlar kiritilganda, avval tasdiqlangan usulning validatsiya xususiyatlari tasdiqlanishi kerak. Quyidagi o'zgarishlar tasdiqlanishi kerak:

• jelga qo'llaniladigan turli xil miqdordagi namunalardan foydalanish;
• oqsillarni jeldan membranaga o'tkazish shartlarini o'zgartirish, shu jumladan ishlatiladigan uskunani o'zgartirish;
• bufer eritmalar tarkibidagi o'zgarishlar;
• tekshirilayotgan moddani aniqlash usulini o'zgartirish.

Eslatmalar

1. Proteinni uzatish uchun bufer eritmasi pH 8,3. Agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqa ko'rsatmalar mavjud bo'lmasa, quyida tavsiflangan eritmalarni tayyorlash usullaridan birini qo'llang (1-variant va 2-variantga qarang). Transfer eritmasi 2-3 marta ishlatilishi mumkin. Eritma 6 oy davomida 4 dan 8 0 S gacha bo'lgan haroratda saqlanadi.

Variant 1. 7,86 g tris(gidroksimetil)aminometan, 33,75 g glisin sig’imi 3000 ml bo’lgan gradusli stakanga solinadi, 2400,0 ml gacha deionlangan suv qo’shiladi va to’liq eriguncha magnit aralashtirgichda aralashtiriladi. PH o'lchanadi, u 8,3 - 8,4 ga teng bo'lishi kerak (eritmaning pH qiymatini kislota yoki gidroksidi bilan moslashtirishga yo'l qo'yilmaydi). 600,0 ml spirt solib aralashtiriladi.

Variant 2. 5,8 g tris(gidroksimetil)aminometan, 2,9 g glitsin, 11,55 ml 10% li natriy dodesil sulfat eritmasi 1000 ml sig‘imli gradusli stakanga solinadi, 800,0 ml deionlangan suv qo‘shiladi va magnitlangan aralashtirilguncha aralashtiriladi. to'liq erish, pH o'lchanadi (8,3-8,4). 200,0 ml 100% metanol solib aralashtiriladi. Agar PVDF membranasi ishlatilsa, u holda bufer eritmasidan natriy dodesil sulfat chiqariladi va spirt miqdori 100,0 ml ga kamayadi va shu bilan qo'shilgan suv hajmi 900,0 ml gacha oshiriladi.

1. Fosfat tamponli sho'r suv (PBS), pH 7,2(farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa). 4500,0 ml deionizatsiyalangan suv gradusli idishga quyiladi va ketma-ket qo'shiladi: 40,0 g natriy xlorid, 1,0 g kaliy xlorid, 5,75 g natriy fosfat 2-suvli, 1,0 g kaliy o'rnini bosuvchi disfosfat tuzi qo'shiladi. oldingisining to'liq tarqatilishi). 70% fosfor kislotasi yoki 45% natriy gidroksid eritmasi bilan pH ni 7,2 ga o'rnating. Hajmi deionlangan suv bilan 5000,0 ml ga sozlang. Eritma filtrlanadi va 3 oy davomida 4 - 8 0 S haroratda saqlanadi.
2. Yuvish uchun bufer eritmasi. 1000 ml o'lchov kolbasiga 5,0 ml 10% li Tween-20 eritmasidan soling, PBS yordamida eritma hajmini belgiga moslang va aralashtiring. Eritma 1 oy davomida 4 °C dan 8 °C gacha bo'lgan haroratda saqlanadi.
3. Bloklovchi bufer eritmasi. Yuvish uchun 100,0 ml bufer eritmasiga, agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, 5,0 mg sigir zardobidagi albumin (yoki boshqa oqsil) qo'shing va to'liq eritmaguncha aralashtiring. Eritma foydalanishdan oldin tayyorlanadi.
4. Antikor bufer eritmasi. Yuvish uchun 100,0 ml bufer eritmasiga, agar farmakopeya monografiyasida yoki me'yoriy hujjatlarda boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, 2,0 mg sigir zardobidagi albumin (yoki boshqa oqsillar) qo'shing va to'liq eritmaguncha aralashtiring. Eritma foydalanishdan oldin tayyorlanadi.

1. TMB yechimi- horseradish peroksidaza rivojlanishi uchun eritma. Foydalanishga tayyor TMB substratidan foydalaning.
2. Ishqoriy fosfataza ishlab chiqish eritmasi. 1 tabletka BCIP/NBT substratini 10,0 ml deionizatsiyalangan suvda eritib yuboring. Eritma foydalanishdan oldin darhol tayyorlanadi.

Umumiy.

Barcha g'arbiy bosqichlash usullari quyidagi bosqichlardan iborat:

1) oqsilni jeldan membranaga o'tkazish;
2) o'ziga xos bo'lmagan sorbsiyani blokirovka qilish;
3) I-antikorlarning adsorbsiyasi;
4) yuvish;
5) II-antikorlarning adsorbsiyasi;
6) yuvish;
7) filtrni ishlab chiqish;

Qaysi turdagi membranani ishlatish kerak: NC yoki PVDV (ular ikkinchisi sezgirroq deyishadi) faqat sizning ta'mingizga bog'liq. NC membranasi mo'rtroq, ammo ehtiyotkorlik bilan ishlashda bu sezilmaydi.

Ballar.

O'tkazishdan oldin, o'tkazgandan keyin faqat rasmda ko'rmoqchi bo'lgan joyni qoldirib, jelni kesish yoki umuman kesmaslik sizning membranani va antikorlarni saqlash istagingizga bog'liq.

Jel hammomida amalga oshirilishi mumkin.

Lekin hamma narsani bir vaqtning o'zida pufakchalarsiz qo'llash yaxshiroqdir.

Yoki alohida chiziq uchun ~ 3mA.

Ba'zan jel chegaralari, quduqlar va boshqalarning holatini belgilash foydali bo'ladi.

Jelni bo'yash orqali o'tkazilgandan keyin jelda qancha protein qolishi mumkinligini nazorat qilishingiz mumkin.

Gibridlanish.

Filtr har doim nam bo'lishi kerak.

Quritilgan PVDF membranasi metanol bilan namlangan bo'lishi kerak.

P tomoni (o'tkazish amalga oshirilgan) eritma bilan aloqa qilish kerak.

A/t bilan duragaylash gibridizatorda 26 o C da kichik silindrlarda yoki 50 ml CF naychalarida amalga oshiriladi. Gibridizatsiya eritmasining hajmi ~ 3 ml (iloji boricha minimal, lekin membrana qurib ketmasligi uchun).

Yuvish va to'ldirish: NT bilan, vannada chayqash (turlardan qopqoq) V = 30-50ml.

Eritmani tashlang yoki unda gibridizatsiya qiling, shunchaki konsentrlangan a/t filtrga tomizmang.

Maxsus bo'lmagan materiallarni to'ldirish uchun sut kukunidan foydalanish yaxshidir (BSA ham mumkin, lekin biz uni kamroq yoqtiramiz). Turli partiyalar fon intensivligida bir oz farq qiladi.

Gibridizatsiya eritmasini 50 ml CF trubasiga quyib, kerakli miqdorda a/t qo'shing, aralashtiring. Filtrni probirka devori bo'ylab yotqizib, gibridizatorga soling.

Agar siz a/ts qanday suyultirishda ishlashini bilmasangiz, buni eksperimental tarzda aniqlashingiz kerak bo'ladi.

Antikorlar bilan o'zaro ta'sir qilish vaqti antikorlaringizga qarab oshirilishi yoki kamayishi mumkin.

Gibridlanish 0,1-0,15M NaCl da amalga oshiriladi, ion kuchining pasayishi kuchli nospetsifik duragaylanishni keltirib chiqaradi.

Juda muhim!!! Antikorlar bilan eritma bir necha marta ishlatilishi mumkin (5-7). Foydalanishdan keyin uni -20 o C da muzlatish kifoya. Ushbu protsedura hech bo'lmaganda gibridizatsiya buferi uchun ishlaydi: 1x PBS (Mg++/Ca++ holda), 0,3-1,0% Quruq sut, Antikorlar.

Immunopresipitatsiyadan so'ng immuno-bo'yashda fonni ikkilamchi antikorlarni birlamchi antikorlarga oldindan konjugatsiya qilish orqali olib tashlash mumkin.

Berilgan protsedura yagona emas. Variantlar:

1. NT bilan hamma narsani tebranish platformasida bajaring, duragaylash va plastik qoplarga qadoqlash (filtrning o'lchamiga qarab V eritma ~ 1,5 ml), vannada yuvish:
1. to'ldirish: 3% sut kukuni, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1h 0,3% sut kukuni, 1x PBS, antiserum;
3. 3 marta x 5 "yuvish: 1x PBS, 0,05% Tween-20;
4. 1x PBS da "II"a/t: 30";
5. 3-bosqichda bo'lgani kabi yuvish.

“I” a/t uchun gibridizatsiya buferidagi quruq sut miqdori sezilarli darajada past bo‘lishiga va “II” a/t uchun buferda uning to‘liq yo‘qligiga qaramasdan, bu usul aniq suratlar berdi. Ko'rinishidan, muvaffaqiyat ishlatiladigan transport vositalarining sifati bilan belgilandi.

2. Yuvish va to'ldirish vannada amalga oshiriladi. Duragaylash: stol ustiga parafilm bo‘lagini (membranadan kattaroq) qo‘ying, ustiga a/t solingan 0,5-1 ml duragaylash eritmasidan. Membranani pufakchalar paydo bo'lishiga yo'l qo'ymaslik uchun (P) tomoni eritmaga qaratib qo'ying va yuqori qismini membrana o'lchamidagi parafilm bilan yoping. 1 soat inkubatsiya qiling.

Bu usul duragaylash aralashmasining hajmini kamaytiradi, lekin duragaylash sifatini yomonlashtirishi mumkin.

Maksimal porlash eritmani qo'llashdan keyin 4-5 dyuymdan keyin sodir bo'ladi (o'rtacha porlash intensivligi 15-20 dyuym davomida saqlanadi).

Kalpastatin miqdorini sinash uchun Western blot tahlili SDS (Laemmli, 1970) ishtirokida 12% PAGEda elektroforez orqali to'qima oqsillarini (har bir chiziq uchun 30 mkg) ajratishni, so'ngra polipeptidlarni nitroselüloza membranasiga yarim quruq o'tkazishni o'z ichiga oladi. bufer: 48 mM Tris-HCl, 39 mM glisin, 0,0375% SDS, 20% metanol, pH 9,2). TBS buferida (50 mM Tris-HCl buferi, 150 mM NaCl, pH 7,5) membranani inkubatsiya qilishdan (2 soat, 20 ° C) so'ng, nonspesifik bog'lanish joylari TBST tamponidagi (TBS) 5% yog'siz sut eritmasi bilan bloklandi. 0,1% Tween 20, pH 7,5) qo‘shilgan holda 1 soat davomida.Keyin membrana ketma-ket kalpastatinga poliklonal antikorlar (suyultirish 1: TBST buferida 2500; 1 soat) va quyon IgG ga (peroksidaza bilan konjugatsiyalangan) antikorlar bilan ta’sir qilindi. suyultirish 1: TBST buferida 2000; 1 soat). Ushbu bosqichlarning har biri TBST buferi bilan takroriy yuvish bilan yakunlandi. Membrana Immun-Star tizimi (Bio-Rad, AQSH) bilan standart davolashdan o'tkazildi.

2.3.6 Boshqa usullar

Protein konsentratsiyasi fraktsiyalar standart sifatida sigir zardobidagi albumin (BSA) yordamida Bredford usuli (Bradford, 1976) bilan aniqlangan.

Densitometriya zimogramma va rentgen plyonkasidagi chiziqlar standart "Image J" dasturi yordamida amalga oshirildi.

Statistik ma'lumotlarni qayta ishlash MS Excel va StatGraphics dasturiy paketlaridan foydalangan holda o'zgaruvchanlik statistikasining umume'tirof etilgan usullaridan foydalangan holda amalga oshirildi. Farqlarning ahamiyati parametrik bo'lmagan U testi (Wilcoxon-Mann-Whitney testi), shuningdek, bir tomonlama dispersiya tahlili (Korosov, Gorbach, 2007) yordamida baholandi.

3-bob. Tadqiqot natijalari va muhokamasi

3.1. Estrogen terapiyasi paytida beta-amiloid tomonidan qo'zg'atilgan neyrodegeneratsiyaga uchragan kalamushlarda kalpain/kalpastatin tizimi

12 va 24 oylik katta yoshdagi Wistar kalamushlarida neyrodegeneratsiya paydo bo'ldi. Eksperimental ta'sir amiloid prekursor oqsilining 42 a'zoli bo'lagi - Abeta (1-42) (Altsgeymer kasalligining eksperimental modeli), shuningdek, beta-amiloid peptidni intraserebral yuborish va intranazal yuborishdan iborat edi. neyroprotektor (estradiol). Hayvonlar orasida quyidagilar aniqlandi: nazorat guruhi - soxta operatsiya (o'ng hipokampus sohasida 2 mkl tuz eritmasi); birinchi tajriba guruhi - 2 mkl Abeta (1-42) peptid eritmasi (5 mkg peptidga to'g'ri keladi) o'ng hipokampus maydoniga; ikkinchi eksperimental guruh - shunga o'xshash Abeta (1-42) peptid in'ektsiyasidan so'ng, har kuni 0,1 mg 17-beta-estradiolni intranazal yuborish.

Aniqlanishicha, asab to'qimalarida amiloidogen peptid mavjud bo'lganda, kalpain tizimining faollashishi sodir bo'ladi va faollik darajasi asab to'qimalarining hujayra o'limining intensivligi (neyron zichligi) bilan ijobiy bog'liqdir. Kalpainlarni tartibga solish ferment oqsili (yoki uning individual shakllari - turli genlarning mahsulotlari) sintezi darajasida ham, kalpastatinning endogen inhibitori bilan bog'langan avtoliz jarayonlari tufayli translatsiyadan keyingi darajada ham amalga oshirilishi mumkin. allosterik regulyatorga - kaltsiy.

2-sonli hayvonlar guruhida kazein zimografiyasi bilan aniqlangan avtolizlangan kalpainlar (118 kDa) hovuzining ko'payishi in vivo jonli holda kalpainlarning faollashuvini aks ettiradi. M-kalpainning kuzatilgan faollashuvi (120 kDa), ko'rinishidan, boshqa ko'plab holatlarda bo'lgani kabi, sitoplazmada ortiqcha kaltsiy bilan bog'liq. Kalpain faolligini tartibga solishning ushbu yo'lining yana bir tasdig'i bizning tadqiqotimizda aniqlangan ularning inhibitori - kalpastatinning barqaror darajasidir.

Ma'lum bo'lishicha, estradiol terapiyasi asab to'qimalarida kalpainlarning umumiy faolligi va alohida fraksiyalarning faolligi pasaygan holda kalpain giperaktivatsiyasi ta'sirini bekor qiladi. Estradiol borligida kalpain prekursorining kichikroq qismi avtolizga va natijada faollashuvga uchraydi. Eksperimental hayvonlarda kalpain faolligini tartibga solish mexanizmini keyingi o'rganish, xususan, ortiqcha kaltsiy manbasini aniqlash va bu patologik oqimlarning oldini olish vositalarini topishga qaratilgan tajribalar zarur.

Miya to'qimalarida proteazoma sintezi darajasi boshqa organlarga nisbatan past va alfa-1,2,3 miqdoriga ko'ra, yoshga qarab pasayadi (18, 24 va 30 oylik hayvonlardagi ko'rsatkichlarni solishtirganda). 20S va 26S proteazomalari uchun universal bo'lgan yadro 20S zarrasining alfa halqalarini tashkil etuvchi ,5,6 ,7 proteazoma subbirliklari.

Eksperimental hayvonlarda miyaning turli sohalarida katepsinlarning ifodalanish darajasi va faolligining o'zgarishi tasdiqlangan. Bizning tajribamizda beta-amiloid peptidning intraserebral kiritilishi sezilarli o'sishga olib keldi (p.<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Bizning ma'lumotlarimiz beta-amiloid va estradiolning Morris suv labirintidan foydalangan holda baholangan kalamushlarda kognitiv ishlashga sezilarli ta'sirini ko'rsatdi. Oldindan o'qitilgan urg'ochi va erkak kalamushlarda beta-amiloid peptidni gippokampusga kiritilgandan so'ng, sezilarli (p)<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Miya bo'limlarini konfokal mikroskopiya natijalari shuni ko'rsatdiki, beta-amiloid peptidni yuborish miyaning o'ng va chap (kamroq) yarim sharlaridagi to'qimalarda uning immunoreaktivligi darajasining sezilarli darajada oshishiga olib keldi. Ushbu natijalar xulq-atvorga oid ma'lumotlar bilan bir qatorda, qo'llaniladigan amiloid peptid preparatining samaradorligini ko'rsatadi va Altsgeymer kasalligining tanlangan modelining vakili ekanligini isbotlaydi. Estradiolning keyingi qo'llanilishi kalamushlar miyasida beta-amiloid miqdorini deyarli nazorat qilish darajasiga tushirdi. Estradiol bilan davolash qilingan kalamushlarda amiloid konlarining kamayishi asab to'qimalarida ulardan foydalanishga qaratilgan ma'lum moslashuv jarayonlarining boshlanishini ko'rsatadi.

Estradiolning neyroprotektiv roli mexanizmi hali to'liq tushunilmagan, garchi bu hodisa uzoq vaqt davomida qayd etilgan. Neyroprotektor sifatida estradioldan foydalanish bir necha sabablarga ko'ra belgilanadi. Birinchidan, estradiolning neyroprotektiv ta'siri juda yaxshi ma'lum va adabiyotda tasvirlangan (McEwen va boshq., 2001; Asimiadou va boshq., 2005; Lebesgue va boshq., 2009). Ikkinchidan, estradiol so'zning to'liq ma'nosida neyrosteroid ekanligi ko'rsatilgan, chunki miyada uning sintezi uchun zarur bo'lgan barcha fermentlar mavjud (Stoffel-Vagner, 2001; Reddy, 2010). Uchinchidan, estradiolning neyroprotektiv ta'siri uning antioksidant (Behl va boshq., 1997) va anti-apoptotik (Asimiadou va boshq., 2005) ta'siri, ya'ni Abeta peptidiga qarama-qarshi ta'sirlar bilan bog'liqligi ma'lum.

Olingan natijalar asab to'qimalarining toksik peptidning kiritilishiga moslashuvchan javobini ko'rsatishi mumkin. Ba'zi nashrlar lizosomal avtofagiya tizimi beta-amiloid peptidning parchalanishida ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatadi (Nixon, 2007). Ehtimol, estradiol oqsil moddasining autofagiyasini rag'batlantiradi; Buni miya to'qimalarida Abeta peptidining tarkibi to'g'risidagi ma'lumotlar ham, lizosoma proteinazalarining faolligi va ifoda darajasini baholash ham tasdiqlaydi. Floresan immunohistokimyosi estradiol bilan neyroprotektiv terapiya olgan kalamushlarda beta-peptid miqdorining pasayishini aniqladi.

Tajribada olingan ma'lumotlarga asoslanib, quyidagi xulosalar chiqarish mumkin. 1. Lizosomal proteinazalar CtsD, CtsB, CtsL va proteazomalarning alfa subbirliklari genlarini ifodalash darajasi va ular kalamushlarning bosh miya po'stlog'ida kodlaydigan fermentlarning faolligi qarigan sari pasayadi. Aksincha, keksa yoshdagi hayvonlarda kalpainlarning faolligi oshadi. 2. Katepsin D ning ifodalanish darajasi va faolligi, shuningdek, kaltsiyga bog'liq proteolizning intensivligi beta-amiloid peptidni intraserebral yuborishdan so'ng kalamushlarning hipokampusida va miya yarim korteksida sezilarli darajada oshadi va hayvonlarning kognitiv funktsiyasi buziladi. . 3. Beta-amiloid intoksikatsiyasi fonida estradiolni qo'llash kalamushlarning hipokampusida ushbu peptid tarkibining pasayishiga va eksperimental hayvonlarda biokimyoviy va xulq-atvor ko'rsatkichlarining yaxshilanishiga olib keladi. 4. Estrogenlar tomonidan lizosomal funktsiyaning farmakologik faollashuvi Altsgeymer kasalligida Abeta olib tashlanishiga yordam berishi mumkin; Bu holatda kaltsiy gomeostazini normallashtirish kalpain tizimining patologik faollashuvini va shu bilan birga, kalpaga bog'liq bo'lgan hujayra o'lim yo'llari bo'ylab neyronlarning yo'qolishini oldini oladi.

Yuqumli kasalliklarni laboratoriya diagnostikasi amaliyotida ba'zan umumiy patogenga emas, balki uning ma'lum oqsillariga (antigenlariga), ya'ni o'ziga xos antitellar spektriga antikorlarni aniqlash zarurati tug'iladi. Agar bu maqsadda ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlil usuli qo'llanilsa, unda bu holda birinchi navbatda patogen madaniyatdan kerakli antijenlarni ajratib olish va tozalash kerak. Olingan oqsillar qattiq fazaga alohida qo'llaniladi. 96-quduqli plastinkadan foydalanilganda, har bir quduqqa bir turdagi antigen joylashtiriladi. Keyin o'ziga xos antikorlar bilvosita usul bilan aniqlanadi.

Quduqda ma'lum bir antijen bilan ijobiy reaktsiya mavjudligiga qarab, tegishli o'ziga xos antikorlarning mavjudligini aniqlash mumkin. Ushbu turdagi immunoenzim test tizimlari ishlab chiqaruvchi kompaniyalar tomonidan taklif etiladi, ammo immunoblotting usuli (Western blot) ko'proq ma'lumot mazmuni va tadqiqotning o'zini bajarish qulayligi tufayli keng tarqaldi.

Immunitetni blokirovka qilish qon zardobidagi antikorlarni bir vaqtning o'zida va bir vaqtning o'zida patogenning barcha diagnostik ahamiyatga ega oqsillariga differentsial ravishda aniqlash imkonini beradi. Ingliz tilidan Western blot tarjimasi G'arbiy transfer (so'zma-so'z - blotting) degan ma'noni anglatadi. Ushbu noodatiy atamaning tarixi quyidagicha.

1975 yilda E. Sautern ismli olim birinchi marta elektroforetik ajratilgan DNK parchalarini jeldan membranaga o'tkazish usulini taklif qildi. Muallifning so'zlariga ko'ra, usul "South blot" deb nomlangan, bu "janubiy o'tkazish" degan ma'noni anglatadi. RNK molekulalarini uzatish usuli, o'z navbatida, mutaxassislar tomonidan Northern blot - "shimoliy uzatish" laqabini oldi. Avvaliga hazil sifatida, keyin bu nom rasmiy ilmiy adabiyotlarda o'rnatildi.

1979 yilda G. Towbin oqsillarni tozalash bo'yicha birinchi tajribalar natijalarini e'lon qildi. Biologik makromolekulalarni uzatish usullari uchun "geografik" nomlar an'analarini davom ettirgan holda, bu usul "G'arbiy" transfer - Western blot deb atala boshlandi.

Ushbu usulning birinchi bosqichi natriy dodesil sulfat (SDS) ishtirokida poliakrilamid jelida patogen oqsillar aralashmasini elektroforetik ajratishni o'z ichiga oladi. SDS sirt faol moddasi bo'lib, oqsil molekulalarini bir tekisda o'rab oladi va ularga taxminan bir xil kattalikdagi manfiy zaryad beradi. Shuning uchun molekulalar elektr maydonida bir yo'nalishda harakat qiladi va harakat tezligi faqat oqsil molekulasining (molekulyar og'irligi) hajmiga bog'liq.

Elektroforetik protsedura natijasida jel plitasi olinadi, uning qalinligida oqsillar alohida nozik chiziqli zonalar shaklida joylashgan. Harakat yo'nalishi bo'yicha ular quyidagi tartibda bo'linadi: katta molekulyar og'irligi taxminan 120-150 kDa bo'lgan oqsillar boshlang'ichga yaqinroq, massasi 5-10 kDa bo'lgan oqsillar esa marraga eng uzoqqa o'tgan. chiziq. Ikkinchi bosqichda jel plitasi nitroselüloz varag'iga joylashtiriladi va bu struktura to'g'ridan-to'g'ri oqim manbai elektrodlari orasiga joylashtiriladi. Elektr maydoni ta'sirida oqsillar g'ovakli geldan zichroq membranaga oqib o'tadi va u erda ular mustahkam mahkamlanadi.

Olingan dog'lar membranadagi antigensiz joylarni to'sib qo'yadigan antigenik jihatdan befarq oqsillarni va/yoki noionik yuvish vositalarini (Tween 20) o'z ichiga olgan blokirovka qiluvchi eritma bilan ishlanadi. Keyin membrana varag'i tor chiziqlar bilan kesiladi, shunda har bir chiziq barcha antijenik fraktsiyalarni o'z ichiga oladi. Ta'riflangan qadamlar ishlab chiqaruvchi tomonidan amalga oshiriladi.

Immunoblotting yordamida antikorlarni aniqlash uchun tijorat test tizimlarida sinovga tayyor bo'lgan dog'lar (chiziqlar yoki chiziqlar) mavjud. Foydalanuvchi bilvosita usul yordamida patogen oqsillarga xos antikorlarning butun spektrini aniqlaydi. Rangli (fermentativ) reaksiyani amalga oshirish uchun xromogen sifatida eriydigan rangsiz modda ishlatiladi, uning mahsuloti rang oladi, erimaydi va nitroselülozaga cho'kadi (cho'kadi).

Ketma-ket immun va fermentativ reaktsiyalar natijasida, sinov namunasida patogen oqsillarga antikorlar mavjud bo'lganda, dog'da qorong'u ko'ndalang chiziqlar paydo bo'ladi, ularning joylashishi ma'lum patogen oqsillar zonasida joylashgan. Har bir bunday tasma mos keladigan antigenga o'ziga xos antikorlarning mavjudligini ko'rsatadi. Immunoblotting tomonidan o'tkazilgan tadqiqot natijasi patogenning o'ziga xos oqsillariga antikorlar ro'yxati shaklida berilgan. Masalan: "p17 va p24 oqsillariga antikorlar aniqlandi."

Nitroselüloz blotlari ishlab chiqilgandan keyin uzoq vaqt davomida quritilgan holda saqlanishi mumkin. Biroq, rangning intensivligi sezilarli darajada zaiflashadi. Skanerlar yordamida nam dog'larni suratga olish yoki ularning grafik tasvirlarini shaxsiy kompyuterlar xotirasiga kiritish mumkin. Maxsus kompyuter dasturlari natijalarni qayta ishlash va dinamik kuzatish paytida antikor spektrining dinamikasini tezda kuzatish imkonini beradi.

Western blotting - bu Lyme kasalligini keltirib chiqaradigan bakteriyalarga qarshi maxsus antikorlarni qidiradigan usul. Western blot testi nima? Tadqiqot natijalarini qanday izohlash mumkin?

Western bloting- bu Lyme kasalligini keltirib chiqaradigan bakteriyalarga qarshi organizm ishlab chiqaradigan antikorlarni qidiradigan test. Bakteriyalar yuzasida antijenler mavjud bo'lib, ularga qarshi tananing IgM va IgG sinflarida o'ziga xos antikorlari mavjud. IgM.

Immunoglobulin M (IgM) - tanamiz ma'lum bir patogen bilan birinchi marta uchrashganda ishlab chiqariladi. Berilgan patogenga nisbatan IgM miqdorining oshishi kasallik jarayonining boshlanishini ko'rsatadi.

IgM dan keyin organizm tomonidan immunoglobulin G (IgG) ishlab chiqariladi, eng yuqori darajaga infektsiyadan taxminan olti oy o'tgach erishiladi va IgM dan farqli o'laroq, antikorlar qonda juda uzoq vaqt, hatto bir necha yil qolishi mumkin.

Western Blot testi - bajarish uchun ko'rsatmalar

Western blot borreliozni tashxislashning ikkinchi bosqichida - Elishay testi (birinchi test) ijobiy yoki shubhali natija berganda qo'llaniladi. Biroq, Elishay testi aniq salbiy bo'lsa, u qo'llanilmaydi.

Western bloting - sinov nima?

Borrelioz (Lyme kasalligi) uchun Western Blot testi bakteriyalarning turli qismlariga antikorlarni aniq baholaydi. Har xil antikorlar
Alohida bakterial bo'laklarga qarshi nitroselüloz qog'ozda qora chiziqlar sifatida grafik tarzda aks ettiriladi.

1. Sinovni o'tkazish uchun ikkita asosiy element talab qilinadi: bemorning qon zardobi va o'ldirilgan va parchalangan madaniyatli borrelioz bakteriyalari.

Shomil chaqishdan keyin tez orada bu testni o'tkazmang. Kamida 4 hafta kuting. Antikorlarning ikkala sinfida Western Blotting tadqiqotining narxi taxminan 2500-5000 rublni tashkil qiladi.

2. Elektr tokining ta'siri ostida taqsimlanish omillarga, birinchi navbatda hujayra madaniyatidan olingan bakteriyalarga, shu jumladan bakterial oqsillarga (antigenlarga) sodir bo'ladi. Keyin bu oqsillar nitroselüloza membranasiga o'tkaziladi. Membrana chiziqlar bilan kesiladi.

3. Antigen chizig'i bemorning qon zardobi bilan birgalikda, Sprechete Borrelia antijenleri bilan maxsus bog'langan antikorlarni aniqlaydigan maxsus texnika yordamida bo'yaladi.

4. Bemorning antikorlari borrelioz bakteriyalarining oqsillari (antijenleri) bilan bog'langan joylarda biz xarakterli chiziqlarni (Lyme bakteriyalari bilan infektsiyani ko'rsatadigan) sezamiz. Sinov natijasi ijobiy.

Har bir tasma bakterial oqsilga (antigen) mos keladi. Borrelioz hujayra oqsillari va antikorlari birlashmasa, tarmoqli paydo bo'lmaydi. Keyin natija salbiy bo'ladi.

Western Blot testi - buni qachon qilish kerak?

Lyme kasalligining erta tashxisi serologik oyna deb ataladigan tufayli muammoli. Bu infektsiya boshlanishidan tananing aniqlanishi mumkin bo'lgan antikorlarni ishlab chiqarish boshlanishigacha bo'lgan davr. Lyme kasalligi uchun serologik oyna o'rtacha 4 hafta davom etadi.

Shomil chaqishidan keyin 4 haftadan kamroq vaqt ichida testlarni o'tkazish noto'g'ri salbiy natija olish xavfini tug'diradi.

Western Blot testi - ijobiy natija

Borreliyaga qarshi antikorlarning mavjudligi sizda Lyme kasalligi borligini anglatadi. Biroq, infektsiya faolmi yoki yo'qmi degan savolga javob berish qiyin.

INFEKTSION natijasida paydo bo'lgan IgG antikorlari qonda Lyme kasalligi tashxisidan keyin 10 va ba'zan 20 yil o'tgach ham aniqlanishi mumkin.

Bundan tashqari, aniqlangan IgM antikorlari (odatda infektsiyaning faol belgisi hisoblanadi) doimiy bo'lishi mumkin va faol infektsiyani ko'rsatmaydi.

Western Blot testi - salbiy natija

Sinov kasallikning dastlabki davrida salbiy natija berishi mumkin, ya'ni. Tishlashdan keyingi birinchi haftalarda.

Western blot testi nafaqat Lymega shubha qilinganida, balki H. pylori (oshqozon yarasini keltirib chiqaradigan) yoki OIV infektsiyasi bo'lsa ham amalga oshirilishi mumkin.

Western blot testi boshqa holatda ham noto'g'ri salbiy natija berishi mumkin - eski surunkali borreliozda antikorlar ishlab chiqarish to'xtatilganda yoki antikorlar ushbu kasallikka qarshi kurashda to'liq ishlatilganda.

Lyme kasalligining shubhasi kuchli bo'lsa, qonda antikorlar mavjud bo'lgan nuqtaga erishish uchun Western Blot testini bir necha marta, masalan, har bir necha haftada takrorlash kerak.

Faol Lyme kasalligida antikorlarning mavjudligi o'zgarib turadi va testi salbiy bo'lgan odam bir necha haftadan so'ng yana sinovdan o'tganda ijobiy natija olish imkoniyatiga ega. Ba'zida tashxis faqat to'rtinchi yoki beshinchi martadan keyin tasdiqlanadi.

Bunday holatda, ba'zi shifokorlar infektsiyani boshqa yo'l bilan tasdiqlashga harakat qilishadi: ular bemorni bir necha hafta davomida antibiotiklar bilan davolashadi va 5-6 haftadan so'ng uni Western blotingga yuborishadi.

Bu vaqt davomida antibiotiklar bilan davolash surunkali kasallikni davolamaydi, ammo immunitet tizimini etarlicha o'zgartiradi, shuning uchun qonda aniqlangan antikorlar etarli bo'ladi. Western blot testining natijasi Lyme kasalligini davolashga ixtisoslashgan shifokor tomonidan talqin qilinishi kerak.

WB testi antibakterial terapiya paytida ham amalga oshirilishi mumkin, ammo antibiotiklar bilan ijobiy natija ehtimoli biroz kamroq. Ushbu test yordamida kasallikni aniqlashning eng oson usuli - antibiotik terapiyasini to'xtatgandan keyin 6 hafta o'tgach.

Muhim

Tadqiqotning talqini - bantlarning talqini. Umumiy qoida sifatida, shuni taxmin qilish kerakki, bantlar qanchalik ko'p bo'lsa, tashxis shunchalik ishonchli bo'ladi. Uchta chiziq haqiqatan ham katta ishonchdir va 5-6 chiziq deyarli 100% ehtimollik bilan Lyme kasalligini anglatadi.

IgM guruhlari diagnostik ahamiyatga ega, chunki ular Shomil bilan yuqadigan borreliozning faol bosqichini ko'rsatadi, ammo IgM sinfida aniqlangan antikorlar (IgM chiziqlari) doimiy bo'lishi mumkin va faol infektsiyani ko'rsatmaydi. Ma'lum bo'lishicha, IgM infektsiyaning boshida va surunkali Lyme kasalligida mantiqqa zid ravishda yuqori bo'ladi.

IgG antikorlarining yuqori darajasi qoldiq infektsiya deb hisoblanishi yoki surunkali faol kasallikni ko'rsatishi mumkin.

Hatto salbiy test natijasi ham Lyme kasalligi mavjud emas degani emas. Salbiy test natijasi faqat qonda borrelioz bakteriyalariga qarshi antikorlar yo'qligini anglatadi - bu, masalan, bakteriyalar tanaga kirgan va antikor ishlab chiqarish hali boshlanmagan bo'lsa (shifokorlar bu davrni serologik oyna deb atashadi).

Ushbu tadqiqotni o'tkazishda qo'llaniladigan usullarning xilma-xilligi tufayli talqin qilish bo'yicha universal tavsiyalar berish qiyin. Har bir laboratoriya o'z mezonlaridan foydalanadi.

Kasallikni faqat simptomlar va laboratoriya tekshiruvlari natijalariga ko'ra tibbiy mutaxassis aniqlay oladi. Wester Blot testini simptomlarni hisobga olmasdan talqin qilish mumkin emas.