Tabela e Përmbajtjes

GPM.1.7.2.0022.15 Përcaktimi i autenticitetit dhe pastërtisë së produkteve medicinale imunobiologjike duke përdorur metodën Western blot

ARTIKU I PËRGJITHSHËM FARMAKOPE

Prezantohet për herë të parë

Kjo monografi e përgjithshme farmakopeale zbatohet për metodën Western blot, një nga variantet e imunoblotting-it, e cila përdoret për të vlerësuar origjinalitetin dhe pastërtinë e produkteve medicinale imunobiologjike (IMPs) të bazuara në proteina shumë të pastruara, përfshirë ato të marra duke përdorur teknologjinë e ADN-së rekombinante.

Në fazën e parë, elektroforeza kryhet në xhel poliakrilamid me dodecil sulfat natriumi (e ashtuquajtura elektroforezë SDS-PAGE) për të ndarë proteinat. Proteinat më pas transferohen në një membranë nitroceluloze ose membranë PVDF. Zbulimi kryhet duke përdorur antitrupa specifikë për proteinën që zbulohet, të konjuguar me fosfatazë alkaline ose peroksidazë rrikë (versioni i drejtpërdrejtë i ELISA), ose duke përdorur në mënyrë sekuenciale antitrupat e parë ndaj proteinës që zbulohet dhe antitrupat e dytë (të ashtuquajturat serum antiglobulin). ), antitrupat e parë specifikë për imunoglobulinën, të konjuguar me fosfatazën alkaline ose peroksidazën e rrikës (versioni indirekt i ELISA).

Ky OFS përshkruan një metodë zbulimi të bazuar në një reaksion ngjyre, si një nga më të përdorurat aktualisht. Për zbulimin, mund të përdoren gjithashtu metoda kemilumineshente, duke përfshirë kimilumineshencën e zgjeruar dhe metodat e etiketimeve radioaktive ose fluoreshente (RIA ose RIF).

Testi kryhet me substanca farmaceutike ose produkte të gatshme.

Gjatë vlerësimit të autenticitetit, në fazën e elektroforezës, përveç mostrave të testuara, në pusetat e xhelit duhet të shtohen zgjidhjet e mëposhtme: një kampion kontrolli negativ (bufer i përgatitjes së mostrës 1-fish), një përzierje e shënuesve të peshës molekulare (përdorimi i Rekomandohen shënues të peshës molekulare të ngjyrosur paraprakisht), një mostër standarde e proteinës që testohet (nëse disponohet), e çertifikuar në mënyrën e përcaktuar. Kur vlerësohet pastërtia (papastërtitë), duhet të sigurohet shtesë për shtimin e një kampioni me një përqendrim të proteinës që korrespondon me kufirin e zbulimit ose sasisë së papastërtive (në varësi të qëllimit të metodës) dhe të vendosur në bazë të rezultateve të metodës. vërtetimi. Kur vlerësohet pastërtia, është e nevojshme të krahasohen rezultatet e blotit me rezultatet e elektroforezës së xhelit të poliakrilamidit; teknika duhet të zbulojë 1% papastërti.

Metodologjia

Për të ndarë proteinat sipas peshës së tyre molekulare, elektroforeza kryhet fillimisht në përputhje me procedurën e përshkruar në Monografinë e Farmakopesë së Përgjithshme "Elektroforeza në xhel poliakrilamide".

Për të kryer transferimin e proteinave, përdoret një pajisje për transferimin e proteinave. E gjithë puna kryhet duke përdorur doreza gome. Vëllimi i të gjitha solucioneve të përdorura duhet të jetë i mjaftueshëm për të zhytur plotësisht membranën në të cilën transferohen proteinat.

Pas elektroforezës për përgatitjen e xhelit për imunoblotting, ai mbushet me një tretësirë ​​tampon për transferimin e proteinave (përveç rasteve kur tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator), vendoset në një shaker orbital dhe mbahet për 10-15 minuta. Më pas përgatitet një fletë nitroceluloze ose membranë PVDF që korrespondon me madhësinë e xhelit. Kur përdoret një membranë nitroceluloze, fleta mbahet për 5 minuta në ujë të deionizuar, dhe më pas 5 minuta në një tretësirë ​​tampon për transferimin e proteinave (përveç rasteve kur tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator). Kur përdorni një membranë PVDF, ajo duhet të mbahet në një tretësirë ​​metanoli ose alkooli për 10-15 minuta dhe më pas duhet të kryhen të njëjtat hapa si për një membranë nitroceluloze.

Për të transferuar proteinat në një membranë nitrocelulozë ose PVDF, mblidhet një "sanduiç". Për ta bërë këtë, një sfungjer i veçantë i përfshirë me pajisjen e transferimit të proteinave laget me tretësirë ​​tampon transferimi të proteinave dhe vendoset në një kornizë plastike të veçantë, mbi të cilën një deri në tre fletë letre filtri (për shembull, Whatman 3MM), të prera paraprakisht për t'u përshtatur. madhësia e membranës dhe proteinat e njomura në tretësirën e transferimit. Sipër vendoset një xhel, në sipërfaqen e të cilit vendoset me kujdes një fletë e përgatitur me membranë nitroceluloze ose PVDF (pa flluska ajri). Nga një deri në tre fletë letre filtri, të lagur paraprakisht në një tretësirë ​​të transferimit të proteinave, vendosen në membranë dhe mbulohen nga sipër me një sfungjer të dytë special të njomur në një zgjidhje transferuese proteinash. Korniza fiksohet me kapëse dhe zhytet ngadalë në një pajisje elektroforeze të mbushur me një zgjidhje të transferimit të proteinave, me fletën e membranës përballë anodës. Ndizni pajisjen. Transferimi elektroforetik i proteinave kryhet në temperaturën e dhomës për 25 minuta, duke vendosur kufirin aktual në shpejtësinë A max = 2 mA/cm 2 (për shembull, për një xhel me përmasa 10 × 10 cm 2 A max = 200 mA), përveç rasteve kur tregohet ndryshe në artikullin ose dokumentacionin rregullator të farmakopesë.

Lejohet përdorimi i pajisjeve për transferimin gjysmë të thatë të proteinave nga xheli në membranë në përputhje me udhëzimet për përdorimin e tij.

Pas përfundimit të transferimit, "sanduiçi" çmontohet. Membrana lahet me solucion fiziologjik të puferuar me fosfat (PBS).

Plotësia e transferimit të proteinave vlerësohet vizualisht nga transferimi i shënuesve me ngjyrë të peshës molekulare, të gjitha brezat kryesore të proteinave të të cilave duhet të zbulohen në membranë.

Zbulim

Për të zbuluar rezultatet e metodës Western blot, ilaçi testues trajtohet (hibridizohet) me antitrupa. Për ta bërë këtë, membrana me proteinat e transferuara në të vendoset në një enë me një zgjidhje tampon bllokues dhe inkubohet në një shaker orbital për 30-60 minuta (përveç rasteve kur parashikohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator) për të parandaluar thithjen jospecifike të antitrupa në membranë.

Pas kësaj, lani membranën në një tretësirë ​​tampon larës tre herë për 5 minuta, përveç nëse specifikohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator.

Pastaj membrana trajtohet me një tretësirë ​​të antitrupave të parë ndaj proteinës që analizohet, e përgatitur duke përdorur një tretësirë ​​tampon për antitrupa (përveç rasteve kur tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator) menjëherë përpara përdorimit në përputhje me udhëzimet për përdorim. Trajtimi me antitrupa kryhet në temperaturën e dhomës për 30-60 minuta (përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator).

Më pas, membrana lahet tre herë për 5 minuta me një tretësirë ​​tampon për të hequr antitrupat e palidhur në një shaker orbital në temperaturën e dhomës, përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator.

Pas larjes së membranës, trajtimi (hibridizimi) kryhet me një zgjidhje të antitrupave të dytë. Antitrupat poliklonalë ndaj imunoglobulinave të specieve shtazore që janë përdorur për të marrë antitrupat e parë përdoren si antitrupa të dytë. Këto antitrupa janë të konjuguar me një enzimë (peroksidazë rrikë ose fosfatazë alkaline). Për të kryer këtë hap, përsëritni procedurën e përshkruar më sipër, duke zëvendësuar tretësirën e parë të antitrupave me një tretësirë ​​të dytë të antitrupave. Pastaj membrana lahet nga antitrupat e dytë të palidhur në një mënyrë të ngjashme me të parën.

Zhvillimi i modelit imunoblot në membranë kryhet me një zgjidhje të substratit tetrametilbenzidine (TMB) për antitrupat e konjuguar me peroksidazën e rrikës, ose një zgjidhje për zhvillimin e fosfatazës alkaline - kur përdorni antitrupa të konjuguar me fosfatazën alkaline (përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator).

Reagimi ndërpritet duke e larë blotin me ujë të dejonizuar. Uji i tepërt hiqet nga sipërfaqja e membranës me letër filtri dhe thahet në ajër në një vend të errët.

Vlerësimi i rezultateve

Gjatë vlerësimit të autenticitetit, brezat me ngjyra kryesore në membranën e zhvilluar duhet të korrespondojnë me brezat me ngjyra kryesore në elektroferogram.

Sasia e substancës së analizuar dhe përmbajtja e papastërtive, si dhe raporti i tyre, vlerësohen në mënyrë densitometrike.

Kriteret e përshtatshmërisë së sistemit

Rezultatet e metodës Western blot mund të merren parasysh nëse:

• Shënuesit e peshës molekulare shpërndahen në mënyrë të barabartë përgjatë gjithë gjatësisë së gjurmës përkatëse të xhelit;
• njolla tregon të gjitha shiritat kryesore të identifikuara kur xheli lyhet me Coomassie blu të ndezur R-250 ose G-250;
• identifikohet një mostër me përqendrimin minimal të përcaktuar në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator

Kriteret e pranimit të rezultateve

• Përputhja e njollës së mostrës së provës me blotin e kampionit të referencës, për shembull, kampionit standard përkatës të bazuar në proteinën (substancën) e pastruar;
• pajtueshmëria e peshës molekulare të komponentit kryesor të identifikuar me kërkesat e specifikimeve;
• përputhshmëria e përmbajtjes së papastërtisë së zbuluar në kampionin standard me diapazonin e vendosur në certifikatën për kampionin standard.

Testimi Western blot i identitetit dhe pastërtisë duhet të përdoret me karakteristika të vërtetuara të vërtetimit për specifikën dhe kufirin e zbulimit të papastërtisë.

Karakteristikat e vërtetimit të metodës

Kur përdoret një metodologji për vlerësimin e autenticitetit, është e nevojshme të arsyetohen kriteret për pranueshmërinë e rezultateve; Këshillohet përdorimi i një kampioni standard të bazuar në proteina të pastruar, të çertifikuar në mënyrën e përcaktuar.

Kur përdorni një metodë për të vlerësuar pastërtinë, është e nevojshme të justifikoni kufirin e zbulimit të papastërtisë. Kur bëni një përcaktim sasior, është e nevojshme të justifikoni kufirin e përcaktimit sasior të një papastërtie, të tregoni diapazonin linear kur përcaktoni përbërësin kryesor dhe papastërtitë, saktësinë dhe korrektësinë e metodës. Për këtë qëllim, këshillohet përdorimi i një kampioni standard të bazuar në proteina të pastruar. Kur bëhen ndryshime në metodën e specifikuar në monografinë farmakopeale ose në dokumentacionin rregullator, duhet të konfirmohen karakteristikat e vërtetimit të metodës së miratuar më parë. Ndryshimet e mëposhtme i nënshtrohen vërtetimit:

• përdorimi i numrave të ndryshëm të mostrave të aplikuara në xhel;
• ndryshimi i kushteve për transferimin e proteinave nga xheli në membranë, duke përfshirë ndryshimin e pajisjeve të përdorura;
• ndryshimet në përbërjen e tretësirave tampon;
• ndryshimi i metodës së zbulimit të substancës testuese.

Shënime

1. Tretësirë ​​buferike për transferimin e proteinave pH 8.3. Nëse nuk ka udhëzime të tjera në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator, përdorni një nga metodat për përgatitjen e solucioneve të përshkruara më poshtë (shih Opsionin 1 dhe Opsionin 2). Zgjidhja e transferimit mund të përdoret 2-3 herë. Tretësira ruhet për 6 muaj në një temperaturë prej 4 deri në 8 0 C.

Opsioni 1. 7,86 g tris(hidroksimetil)aminometan, 33,75 g glicinë vendosen në një gotë të shkallëzuar me kapacitet 3000 ml, shtohen deri në 2400,0 ml ujë të deionizuar dhe trazohen në një përzierës magnetik deri në tretje të plotë. Matet pH, i cili duhet të jetë i barabartë me 8,3 - 8,4 (nuk lejohet rregullimi i pH-së së tretësirës me acid ose alkali). Shtoni 600.0 ml alkool dhe përzieni.

Opsioni 2. 5,8 g tris(hidroksimetil)aminometan, 2,9 g glicinë, 11,55 ml solucion dodecil sulfat natriumi 10% vendosen në një gotë të shkallëzuar me kapacitet 1000 ml, shtohen 800,0 ml ujë të dejonizuar dhe trazohen në një trazues magnetik. shpërbërja e plotë, matet pH (8,3-8,4). Shtoni 200.0 ml metanol 100% dhe përzieni. Nëse përdoret një membranë PVDF, atëherë dodecil sulfati i natriumit përjashtohet nga tretësira tampon dhe sasia e alkoolit zvogëlohet në 100.0 ml, duke rritur kështu vëllimin e ujit të shtuar në 900.0 ml.

1. I kripur i puferuar me fosfat (PBS), pH 7.2(nëse nuk tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator). 4500,0 ml ujë të dejonizuar hidhet në një enë të graduar dhe shtohet radhazi: 40,0 g klorur natriumi, 1,0 g klorur kaliumi, 5,75 g fosfat natriumi i zëvendësuar 2-ujor, 1,0 g kripë kaliumi i shtuar është foshub. shpërbërja e plotë e të mëparshmes). Vendosni pH në 7.2 me një tretësirë ​​prej 70% acid fosforik ose një tretësirë ​​prej 45% hidroksid natriumi. Rregulloni volumin në 5000.0 ml me ujë të dejonizuar. Tretësira filtrohet dhe ruhet për 3 muaj në temperaturën 4 - 8 0 C.
2. Zgjidhje tampon për larje. Shtoni 5,0 ml të një solucioni 10% Tween-20 në një balonë vëllimore 1000 ml, rregulloni volumin e tretësirës në shenjë duke përdorur PBS dhe përzieni. Tretësira ruhet për 1 muaj në një temperaturë prej 4 °C deri në 8 °C.
3. Zgjidhje tampon bllokues. Në 100,0 ml tretësirë ​​tampon për larje, shtoni 5,0 mg albuminë të serumit të gjedhit (ose proteina tjetër), përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator, dhe përzieni derisa të treten plotësisht. Tretësira përgatitet para përdorimit.
4. Zgjidhje tampon antitrupash. Në 100,0 ml tretësirë ​​tampon për larje, shtoni 2,0 mg albuminë të serumit të gjedhit (ose proteina të tjera), përveç nëse tregohet ndryshe në monografinë farmakopeale ose dokumentacionin rregullator, dhe përzieni derisa të treten plotësisht. Tretësira përgatitet para përdorimit.

1. Zgjidhja TMB— zgjidhje për zhvillimin e peroksidazës së rrikës. Përdorni substratin TMB, gati për përdorim.
2. Zgjidhje për zhvillimin e fosfatazës alkaline. Shkrihet 1 tabletë e substratit BCIP/NBT në 10,0 ml ujë të dejonizuar. Zgjidhja përgatitet menjëherë para përdorimit.

Janë të zakonshme.

Të gjitha metodat perëndimore të skenimit përbëhen nga hapat e mëposhtëm:

1) transferimi i proteinave nga xheli në membranë;
2) bllokimi i thithjes jospecifike;
3) adsorbimi i antitrupave I;
4) larje;
5) adsorbimi i antitrupave II;
6) larje;
7) zhvillimi i filtrit;

Çfarë lloj membrane të përdorni: NC ose PVDV (thonë se kjo e fundit është më e ndjeshme) varet vetëm nga shija juaj. Membrana NC është më e brishtë, por me funksionim të kujdesshëm kjo nuk vërehet.

Pikat.

Nëse do të shkurtoni xhelin, duke lënë vetëm zonën që dëshironi të shihni në foto përpara transferimit, pas transferimit, apo të mos shkurtoni fare, varet nga dëshira juaj për të kursyer membranën dhe antitrupat.

Mund të bëhet në një banjë me xhel.

Por është më mirë të aplikoni gjithçka menjëherë pa flluska.

Ose ~ 3 mA për shirit individual.

Ndonjëherë është e dobishme të shënoni pozicionin e kufijve të xhelit, puseve, etj.

Ju mund të kontrolloni se sa proteina mbetet në xhel pas transferimit duke ngjyrosur xhelin.

Hibridizimi.

Filtri duhet të jetë gjithmonë i lagësht.

Membrana PVDF e tharë duhet të laget me metanol.

Ana P (në të cilën u bë transferimi) duhet të jetë në kontakt me zgjidhjen.

Hibridizimi me a/t kryhet në një hibridizer në 26 o C në cilindra të vegjël ose tuba CF 50 ml. Vëllimi i tretësirës së hibridizimit është ~3ml (sa më minimale, por që membrana të mos thahet).

Larja dhe mbushja: me NT, tundja në banjë (kapak nga llojet) V = 30-50ml.

Ose hidheni solucionin ose kryeni hibridizimin në të, thjesht mos e hidhni a/t të koncentruar në filtër.

Për mbushjen e materialeve jo specifike, është mirë të përdorni qumësht pluhur (BSA është gjithashtu e mundur, por ne na pëlqen më pak). Grupe të ndryshme ndryshojnë pak në intensitetin e sfondit.

Derdhni tretësirën e hibridizimit në një tub CF 50 ml, shtoni sasinë e kërkuar të a/t, përzieni. Vendoseni filtrin përgjatë murit të epruvetës dhe vendoseni në hibridizer.

Nëse nuk e dini se në çfarë hollimi funksionojnë a/ts, atëherë do t'ju duhet ta përcaktoni këtë në mënyrë eksperimentale.

Koha e ndërveprimit me antitrupat mund të rritet ose ulet në varësi të antitrupave tuaj.

Hibridizimi kryhet në 0.1-0.15 M NaCl; një rënie në forcën jonike shkakton hibridizim të fortë jospecifik.

Shume e rendesishme!!! Tretësira me antitrupa mund të përdoret disa herë (5-7). Mjafton të ngrihet pas përdorimit në -20 o C. Kjo procedurë funksionon të paktën për buferin e hibridizimit: 1x PBS (pa Mg++/Ca++), 0.3-1.0% Qumësht i thatë, Antitrupa.

Kur bëhet imuno-ngjyrosja pas imunoprecipitimit, sfondi mund të hiqet duke parakonjuguar antitrupat sekondarë me ato parësore.

Procedura e dhënë nuk është e vetmja. Opsione:

1. Bëni gjithçka me NT në një platformë lëkundëse, hibridizimin dhe paketimin në qese plastike (tretësirë ​​V ~1.5 ml, në varësi të madhësisë së filtrit), larja në banjë:
1. mbushja: 3% qumësht pluhur, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1h 0.3% pluhur qumështi, 1x PBS, antiserum;
3. lani 3 herë x 5": 1x PBS, 0.05% Tween-20;
4. "II"a/t: 30" në 1x PBS;
5. larja si në hapin 3.

Pavarësisht përmbajtjes dukshëm më të ulët të qumështit të thatë në tampon hibridizimi për “I” a/t dhe mungesës së plotë të tij në tampon për “II” a/t, kjo metodë dha pamje të qarta. Me sa duket, suksesi u përcaktua nga cilësia e automjeteve të përdorura.

2. Larja dhe mbushja kryhen në një banjë. Hibridizimi: vendosni në tavolinë një copë parafilm (më të madhe se membrana) dhe mbi të 0,5-1 ml tretësirë ​​hibridizimi me a/t. Vendoseni membranën me anën (P) përballë solucionit, duke shmangur flluskat, dhe mbuloni pjesën e sipërme me një copë parafilm në madhësinë e membranës. Inkuboni 1 orë.

Kjo metodë zvogëlon vëllimin e përzierjes së hibridizimit, por mund të përkeqësojë cilësinë e hibridizimit.

Shkëlqimi maksimal ndodh 4-5" pas aplikimit të solucionit (intensiteti i arsyeshëm i shkëlqimit mbahet për 15-20").

Analiza Western blot për të testuar sasinë e kalpastatinës përfshin ndarjen e proteinave të indeve (30 μg për korsi) me elektroforezë në 12% PAGE në prani të SDS (Laemmli, 1970) e ndjekur nga transferimi gjysmë i thatë i polipeptideve në një membranë nitroceluloze. tampon: 48 mM Tris-HCl, 39 mM glicinë, 0.0375% SDS, 20% metanol, pH 9.2). Pas inkubimit (2 orë, 20°C) të membranës në tampon TBS (bufer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5), vendet lidhëse jo specifike u bllokuan me një zgjidhje 5% të qumështit të skremuar në tampon TBST (TBS me shtimin e 0.1% Tween 20, pH 7.5) për 1 orë. Më pas, membrana u ekspozua në mënyrë sekuenciale ndaj antitrupave poliklonalë ndaj kalpastatinës (hollimi 1: 2500 në tampon TBST; 1 orë) dhe me antitrupa ndaj IgG lepuri të konjuguar me peroksidazë ( hollimi 1: 2000 në tampon TBST; 1 orë) 1 orë); Secili prej këtyre hapave u përfundua duke larë të përsëritur me tampon TBST. Membrana iu nënshtrua trajtimit standard me sistemin Immune-Star (Bio-Rad, SHBA).

2.3.6 Metoda të tjera

Përqendrimi i proteinave fraksionet u përcaktuan me metodën Bradford (Bradford, 1976) duke përdorur albuminën e serumit të gjedhit (BSA) si standard.

Densitometria vija në zimogramë dhe film me rreze X u kryen duke përdorur programin standard "Image J".

Përpunimi statistikor i të dhënave u kryen duke përdorur metoda të pranuara përgjithësisht të statistikave të variacionit duke përdorur paketat softuerike MS Excel dhe StatGraphics. Rëndësia e diferencave u vlerësua duke përdorur testin joparametrik U (testi Wilcoxon-Mann-Whitney), si dhe duke përdorur analizën e variancës në një drejtim (Korosov, Gorbach, 2007).

Kapitulli 3. Rezultatet e kërkimit dhe diskutimi

3.1. Sistemi i kalpainës/kalpastatinës në minjtë e nënshtruar neurodegjenerimit të shkaktuar nga beta-amiloide gjatë terapisë me estrogjen

Neurodegjenerimi u shkaktua në minjtë Wistar të grupmoshave më të vjetra - 12 dhe 24 muajsh. Efekti eksperimental konsistonte në administrimin intracerebral të një fragmenti 42-anëtarësh të proteinës pararendëse amiloide - Abeta(1-42) (një model eksperimental i sëmundjes së Alzheimerit), si dhe administrimi i kombinuar intracerebral i peptidit beta-amiloide dhe administrimi intranazal i një neuroprotektor (estradiol). Midis kafshëve u identifikuan: grupi i kontrollit - i operuar me shami (2 μl tretësirë ​​të kripur në zonën e hipokampusit të djathtë); grupi i parë eksperimental - 2 μl zgjidhje peptide Abeta (1-42) (që korrespondon me 5 μg peptid) në zonën e hipokampusit të djathtë; grupi i dytë eksperimental - pas një injeksioni të ngjashëm të peptidit Abeta(1-42), administrimi ditor intranazal i 0.1 mg 17-beta-estradiol.

U zbulua se në prani të peptidit amiloidogjen në indin nervor, ndodh aktivizimi i sistemit kalpain, dhe shkalla e aktivizimit lidhet pozitivisht me intensitetin e vdekjes qelizore të indit nervor (densiteti i neuroneve). Rregullimi i kalpainës mund të kryhet si në nivelin e sintezës së proteinës enzimë (ose formave të saj individuale - produkte të gjeneve të ndryshme), ashtu edhe në nivelin pas përkthimit për shkak të proceseve të autolizës, lidhjes me frenuesin endogjen kalpastatin ose tek rregullatori alosterik - kalciumi.

Rritja e grupit të kalpainave të autolizuara (118 kDa) e zbuluar nga zymografia e kazeinës në grupin e kafshëve nr. 2 pasqyron aktivizimin e kalpainave in vivo. Aktivizimi i vëzhguar i m-kalpainës (120 kDa), me sa duket, si në shumë situata të tjera, shoqërohet me kalcium të tepërt në citoplazmë. Një tjetër konfirmim i kësaj rruge të rregullimit të aktivitetit të kalpainës është niveli i qëndrueshëm i frenuesit të tyre, kalpastatinës, i zbuluar në studimin tonë.

Siç doli, terapia me estradiol anulon efektin e hiperaktivizimit të kalpainës, me uljen e aktivitetit të përgjithshëm të kalpainës në indin nervor dhe aktivitetit të fraksioneve individuale. Në prani të estradiolit, një pjesë më e vogël e prekursorit të kalpainës i nënshtrohet autolizës dhe, rrjedhimisht, aktivizimit. Nevojiten studime të mëtejshme të mekanizmit të rregullimit të aktivitetit të kalpainës në kafshët eksperimentale, në veçanti, nevojiten eksperimente që synojnë përcaktimin e burimit të kalciumit të tepërt dhe gjetjen e mjeteve për të parandaluar këto rryma patologjike.

Niveli i sintezës së proteazomës në indet e trurit është i ulët në krahasim me organet e tjera dhe tenton të ulet me moshën (kur krahasohen treguesit në kafshët 18, 24 dhe 30 muajsh), siç gjykohet nga sasia e alfa-1,2,3 ,5,6 ,7 nënnjësi proteazome që formojnë unaza alfa të grimcave bërthamore 20S, universale për proteazomet 20S dhe 26S.

Ndryshimet në nivelin e shprehjes dhe aktivitetit të katepsinave në zona të ndryshme të trurit te kafshët eksperimentale u konfirmuan. Në eksperimentin tonë, administrimi intracerebral i peptidit beta-amiloide çoi në një rritje të konsiderueshme (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Të dhënat tona treguan efekte të rëndësishme të beta-amiloidit dhe estradiolit në performancën njohëse te minjtë e vlerësuar duke përdorur labirintin e ujit Morris. Në minjtë femra dhe meshkuj të trajnuar më parë, pas injektimit të peptidit beta-amiloide në hipokampus, pati një (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Rezultatet e mikroskopisë konfokale të seksioneve të trurit treguan se administrimi i peptidit beta-amiloide çoi në një rritje të konsiderueshme të nivelit të imunoreaktivitetit të tij në indet e hemisferës së djathtë dhe të majtë (në një masë më të vogël) të trurit. Këto rezultate, së bashku me të dhënat e sjelljes, demonstrojnë efektivitetin e ilaçit peptid amiloide të administruar dhe ofrojnë dëshmi për përfaqësimin e modelit të zgjedhur të sëmundjes Alzheimer. Administrimi i mëvonshëm i estradiolit reduktoi sasinë e beta-amiloidit në trurin e minjve në nivele pothuajse të kontrollit. Reduktimi i depozitave të amiloidit në minjtë e trajtuar me estradiol tregon fillimin e disa proceseve adaptive në indin nervor që synojnë përdorimin e tyre.

Mekanizmi i rolit neuroprotektiv të estradiolit ende nuk është kuptuar plotësisht, megjithëse ky fenomen është vërejtur për një kohë të gjatë. Përdorimi i estradiolit si një neuroprotektor diktohet nga disa arsye. Së pari, efekti neuroprotektiv i estradiolit është mjaft i njohur dhe i përshkruar në literaturë (McEwen et al., 2001; Asimiadou et al., 2005; Lebesgue et al., 2009). Së dyti, është treguar se estradioli është një neurosteroid në kuptimin e plotë të fjalës, pasi truri përmban të gjitha enzimat e nevojshme për sintezën e tij (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). Së treti, dihet se efekti neuroprotektiv i estradiolit shoqërohet me efektet e tij antioksiduese (Behl et al., 1997) dhe antiapoptotike (Asimiadou et al., 2005), pra me efekte të kundërta me ato të peptidit Abeta.

Rezultatet e marra mund të tregojnë një përgjigje adaptive të indit nervor ndaj futjes së një peptidi toksik. Disa publikime tregojnë se sistemi i autofagjisë lizozomale mund të përfshihet në degradimin e peptidit beta-amiloide (Nixon, 2007). Ka të ngjarë që estradioli të stimulojë autofagjinë e materialit proteinik; Kjo dëshmohet si nga të dhënat për përmbajtjen e peptidit Abeta në indet e trurit ashtu edhe nga vlerësimi i aktivitetit dhe nivelit të shprehjes së proteinazave lizozomale. Imunohistokimia fluoreshente zbuloi një ulje të sasisë së peptidit beta në minjtë që merrnin terapi neuroprotektive me estradiol.

Bazuar në të dhënat e marra në eksperiment, mund të nxirren përfundimet e mëposhtme. 1. Niveli i shprehjes së gjeneve të proteinazave lizozomale CtsD, CtsB, CtsL dhe nënnjësive alfa të proteazomave dhe aktiviteti i enzimave që ato kodojnë në korteksin cerebral të minjve zvogëlohet me plakjen. Përkundrazi, aktiviteti i kalpainave në kafshët e grupmoshave më të mëdha rritet. 2. Niveli i shprehjes dhe aktivitetit të katepsinës D, si dhe intensiteti i proteolizës së varur nga kalciumi, rritet ndjeshëm në hipokampus dhe korteksin cerebral të minjve pas administrimit intracerebral të peptidit beta-amiloide, dhe funksioni njohës i kafshëve vuan. . 3. Administrimi i estradiolit në sfondin e intoksikimit me beta-amiloide çon në një ulje të përmbajtjes së këtij peptidi në hipokampusin e minjve dhe një përmirësim të treguesve biokimikë dhe të sjelljes në kafshët eksperimentale. 4. Aktivizimi farmakologjik i funksionit lizozomal nga estrogjenet mund të nxisë heqjen e Abeta në sëmundjen e Alzheimerit; normalizimi i homeostazës së kalciumit në këtë situatë parandalon aktivizimin patologjik të sistemit kalpain dhe, në të njëjtën kohë, humbjen e neuroneve përgjatë rrugëve të vdekjes së qelizave të varura nga kalpaina.

Në praktikën e diagnostikimit laboratorik të sëmundjeve infektive, ndonjëherë ekziston nevoja për të përcaktuar antitrupat jo ndaj një patogjeni në përgjithësi, por ndaj disa proteinave të tij (antigjeneve), domethënë një spektri antitrupash specifikë. Nëse për këtë përdoret metoda e analizës imunosorbente të lidhur me enzimën, atëherë në këtë rast është e nevojshme që fillimisht të izolohen dhe pastrohen antigjenet e nevojshme nga kultura patogjene. Proteinat që rezultojnë aplikohen veçmas në fazën e ngurtë. Në rastin e përdorimit të një pllake 96 pusesh, në çdo pus vendoset një lloj antigjeni. Pastaj antitrupat specifikë përcaktohen me një metodë indirekte.

Nga prania e një reaksioni pozitiv në një pus me një antigjen të veçantë, mund të gjykohet prania e antitrupave specifikë përkatës. Këto lloje të sistemeve të testimit të imunoenzimës ofrohen nga kompanitë prodhuese, por metoda e imunoblotting-ut (Western blot) është bërë e përhapur për shkak të përmbajtjes më të madhe të informacionit dhe lehtësisë së ekzekutimit të vetë studimit.

Bllokimi imunitar mundëson përcaktimin e antitrupave në serumin e gjakut në të njëjtën kohë dhe në të njëjtën kohë në mënyrë të diferencuar me të gjitha proteinat me rëndësi diagnostike të patogjenit. Përkthimi nga anglishtja Western blot do të thotë transferim perëndimor (fjalë për fjalë - blotting). Historia e këtij termi të pazakontë është si më poshtë.

Në vitin 1975, një shkencëtar i quajtur E. Southern propozoi për herë të parë një metodë për transferimin e fragmenteve të ADN-së të ndara elektroforetikisht nga një xhel në një membranë. Sipas autorit, metoda u quajt Southern blot, që përkthyer do të thotë "transferim jugor". Metoda e transferimit të molekulave të ARN-së, nga ana tjetër, u mbiquajt nga ekspertët Northern blot - "transferimi verior". Në fillim si shaka, e më pas ky emër u vendos në literaturën zyrtare shkencore.

Në vitin 1979, G. Towbin publikoi rezultatet e eksperimenteve të para mbi blotting proteinave. Në vazhdim të traditave të emrave "gjeografikë" për metodat e transferimit të makromolekulave biologjike, kjo metodë filloi të quhet transferim "Western" - Western blot.

Hapi i parë i kësaj metode përfshin ndarjen elektroforetike të një përzierjeje të proteinave patogjene në një xhel poliakrilamid në prani të dodecil sulfat natriumi (SDS). SDS, duke qenë një surfaktant, mbështjell në mënyrë të barabartë molekulat e proteinave dhe u jep të gjithëve një ngarkesë negative me madhësi afërsisht të barabartë. Prandaj, molekulat lëvizin në një fushë elektrike në një drejtim, dhe shpejtësia e lëvizjes varet vetëm nga madhësia e molekulës (pesha molekulare) e proteinës.

Si rezultat i procedurës elektroforetike, fitohet një pllakë xhel, në trashësinë e së cilës ndodhen proteinat në formën e zonave të ndara të holla lineare. Sipas drejtimit të lëvizjes, ato ndahen në rendin e mëposhtëm: proteinat me peshë të madhe molekulare, rreth 120-150 kDa, janë më afër fillimit, dhe proteinat me masë 5-10 kDa kanë lëvizur më larg deri në fund. linjë. Në fazën e dytë, pllaka e xhelit vendoset në një fletë nitroceluloze dhe kjo strukturë vendoset midis elektrodave të një burimi të rrymës së drejtpërdrejtë. Nën ndikimin e një fushe elektrike, proteinat rrjedhin nga xheli poroz në një membranë më të dendur, ku ato janë të fiksuara fort.

Njolla që rezulton trajtohet me një zgjidhje bllokuese që përmban proteina antigjenike indiferente dhe/ose detergjentë jojonikë (Tween 20), të cilët bllokojnë vendet pa antigjen në membranë. Fleta e membranës pritet më pas në shirita të ngushtë në mënyrë që çdo rrip të përmbajë të gjitha fraksionet antigjenike. Hapat e përshkruar kryhen nga prodhuesi.

Sistemet e testimit komercial për përcaktimin e antitrupave duke përdorur imunoblotting përmbajnë njollat ​​(shirita ose shirita) që janë gati për testim. Përdoruesi përcakton të gjithë spektrin e antitrupave specifikë ndaj proteinave patogjene duke përdorur metodën indirekte. Një substancë e tretshme pa ngjyrë përdoret si kromogen për të kryer një reaksion me ngjyrë (enzimatik), produkti i të cilit merr ngjyrë, bëhet i pazgjidhshëm dhe vendoset (precipiton) në nitrocelulozë.

Si rezultat i reaksioneve të njëpasnjëshme imune dhe enzimatike, në prani të antitrupave ndaj proteinave patogjene në mostrën e provës, në njollë shfaqen vija të errëta tërthore, vendndodhja e të cilave është në zonën e proteinave të caktuara patogjene. Çdo brez i tillë tregon praninë e antitrupave specifikë ndaj antigjenit përkatës. Rezultati i një studimi të kryer me imunoblotting jepet në formën e një liste antitrupash ndaj proteinave specifike të patogjenit. Për shembull: "janë zbuluar antitrupa ndaj proteinave p17 dhe p24."

Njollat ​​e nitrocelulozës mund të ruhen të thara për një kohë të gjatë pas zhvillimit. Megjithatë, intensiteti i ngjyrës dobësohet ndjeshëm. Njollat ​​e lagura mund të fotografohen ose imazhet e tyre grafike mund të futen në kujtesën e kompjuterëve personalë duke përdorur skanerë. Programet e veçanta kompjuterike ju lejojnë të përpunoni rezultatet dhe të monitoroni shpejt dinamikën e spektrit të antitrupave gjatë vëzhgimit dinamik

Western blotting është një metodë që kërkon antitrupa specifikë kundër baktereve që shkaktojnë sëmundjen Lyme. Çfarë është një test Western blot? Si të interpretohen rezultatet e studimit?

Western blottingështë një test që kërkon antitrupa që trupi prodhon kundër baktereve që shkaktojnë sëmundjen Lyme. Në sipërfaqen e baktereve ka antigjene, kundër të cilave trupi ka antitrupa specifikë në klasat IgM dhe IgG. IgM.

Imunoglobulina M (IgM) - prodhohet kur trupi ynë ndeshet për herë të parë me një patogjen të caktuar. Një rritje në sasinë e IgM kundër një patogjeni të caktuar tregon fillimin e procesit të sëmundjes.

Imunoglobulina G (IgG) prodhohet nga trupi pas IgM, niveli më i lartë arrihet rreth gjashtë muaj pas infektimit dhe ndryshe nga IgM, antitrupat mund të qëndrojnë në gjak për një kohë shumë të gjatë, madje edhe disa vjet.

Testi Western Blot - indikacione për kryerjen

Western blot përdoret në fazën e dytë të diagnostikimit të borreliozës - kur testi ELISA (testi i parë) jep një rezultat pozitiv ose të paqartë. Megjithatë, nuk përdoret kur testi ELISA është qartësisht negativ.

Western blotting - cili është testi?

Testi Western Blot për borreliozën (sëmundja Lyme) vlerëson me saktësi antitrupat ndaj fragmenteve të ndryshme të baktereve. Antitrupa të ndryshëm
kundër fragmenteve individuale bakteriale pasqyrohen grafikisht si vija të zeza në letër nitroceluloze.

1. Për të kryer testin, kërkohen dy elementë kryesorë: serumi i gjakut i pacientit dhe bakteret e borreliozës së kultivuar të vrarë dhe të fragmentuar.

Mos e bëni këtë test menjëherë pas pickimit të rriqrës. Prisni të paktën 4 javë. Kostoja e një studimi Western Blotting në të dy klasat e antitrupave është rreth 2500-5000 rubla.

2. Nën ndikimin e rrymës elektrike, shpërndarja ndodh në faktorë, kryesisht baktere të marra nga një kulturë qelizore, duke përfshirë proteinat bakteriale (antigjenet). Këto proteina më pas transferohen në një membranë nitroceluloze. Membrana pritet në shirita.

3. Shiriti i antigjenit, në kombinim me serumin e gjakut të pacientit, ngjyroset duke përdorur një teknikë të veçantë që zbulon antitrupat që lidhen veçanërisht me antigjenet Sprechete Borrelia.

4. Në zonat ku antitrupat e pacientit janë të lidhura me proteinat (antigjenet) e baktereve të borreliozës, vërejmë vija karakteristike (që tregojnë infeksion me bakteret Lyme). Rezultati i testit është pozitiv.

Çdo brez korrespondon me një proteinë bakteriale (antigjen). Nëse proteinat e qelizave Borreliosis dhe antitrupat nuk kombinohen, brezi nuk do të shfaqet. Atëherë rezultati është negativ.

Testi Western Blot - kur duhet bërë?

Diagnoza e hershme e sëmundjes Lyme është problematike për shkak të të ashtuquajturës dritare serologjike. Kjo është periudha nga fillimi i infeksionit deri në fillimin e trupit që prodhon antitrupa të zbulueshëm. Për sëmundjen Lyme, dritarja serologjike zgjat mesatarisht 4 javë.

Kryerja e testeve më pak se 4 javë pas pickimit të rriqrës paraqet rrezikun e marrjes së një rezultati të rremë negativ.

Testi Western Blot - rezultat pozitiv

Të kesh antitrupa kundër Borrelia do të thotë që ke sëmundjen Lyme. Megjithatë, është e vështirë t'i përgjigjemi pyetjes nëse infeksioni është aktiv apo jo.

Antitrupat IgG që rezultojnë nga infeksioni mund të zbulohen në gjak edhe 10 dhe ndonjëherë 20 vjet pas diagnozës së sëmundjes Lyme.

Ndodh gjithashtu që antitrupat e zbuluar IgM (zakonisht konsiderohen si një shënues aktiv i infeksionit) mund të jenë të qëndrueshëm dhe gjithashtu nuk tregojnë një infeksion aktiv.

Testi Western Blot - rezultat negativ

Testi mund të japë rezultat negativ në periudhën fillestare të sëmundjes, d.m.th. Në javët e para pas pickimit.

Testimi i Western blot mund të kryhet jo vetëm nëse dyshohet për Lyme, por edhe nëse ka infeksion me H. pylori (që shkakton ulçera peptike) ose HIV.

Testi Western blot mund të japë një rezultat të rremë negativ edhe në një situatë tjetër - kur në një borreliozë të vjetër kronike është ndalur prodhimi i antitrupave ose kur antitrupat janë përdorur plotësisht në luftën kundër kësaj sëmundjeje.

Nëse dyshimi për sëmundjen Lyme është i fortë, testi Western Blot duhet të përsëritet disa herë, për shembull, çdo disa javë, për të arritur në pikën ku antitrupat janë të pranishëm në gjak.

Prania e antitrupave në sëmundjen aktive Lyme ndryshon dhe një person që rezulton negativ ka një shans për të dalë pozitiv kur testohet përsëri disa javë më vonë. Ndonjëherë diagnoza konfirmohet vetëm pas herës së katërt ose të pestë.

Në këtë rast, disa mjekë përpiqen të marrin konfirmimin e infeksionit në një mënyrë tjetër: e trajtojnë pacientin me antibiotikë për disa javë dhe pas 5-6 javësh e dërgojnë për Western blotting.

Trajtimi me antibiotikë për këtë kohë nuk do ta shërojë sëmundjen kronike, por do të ndryshojë sistemin imunitar aq sa do të ketë mjaft antitrupa në gjak për t'u zbuluar. Rezultati i një testi Western blot duhet të interpretohet nga një mjek i specializuar në trajtimin e sëmundjes Lyme

Testi WB mund të kryhet edhe gjatë terapisë antibakteriale, por me antibiotikë gjasat për një rezultat pozitiv janë disi më pak të mundshme. Mënyra më e lehtë për të diagnostikuar sëmundjen me këtë test është 6 javë pas ndërprerjes së terapisë me antibiotikë.

E rëndësishme

Interpretimi i studimit është interpretimi i bandave. Si rregull i përgjithshëm, duhet të supozohet se sa më shumë breza, aq më e besueshme është diagnoza. Tre vija janë vërtet një besim i madh, dhe 5-6 vija nënkuptojnë sëmundjen Lyme me pothuajse 100% probabilitet.

Bandat IgM kanë një vlerë më të madhe diagnostike sepse sugjerojnë një fazë aktive të borreliozës së lindur nga rriqrat, megjithëse antitrupat e zbuluar në klasën IgM (bandat IgM) mund të jenë të vazhdueshme dhe të mos tregojnë infeksion aktiv. Rezulton se IgM është i lartë në fillim të infeksionit dhe, në kundërshtim me logjikën, në sëmundjen kronike Lyme.

Nivelet e ngritura të antitrupave IgG mund të konsiderohen si një infeksion i mbetur ose mund të tregojë sëmundje kronike aktive.

Edhe një rezultat negativ i testit nuk do të thotë që sëmundja Lyme nuk është e pranishme. Një rezultat negativ i testit do të thotë vetëm se nuk ka antitrupa në gjak kundër baktereve të borreliozës - kjo mund të ndodhë, për shembull, kur bakteret kanë hyrë në trup dhe prodhimi i antitrupave nuk ka filluar ende (mjekët e quajnë këtë periudhë dritare serologjike).

Për shkak të shumëllojshmërisë së metodave të përdorura për të kryer këtë studim, është e vështirë të bëhen rekomandime universale në lidhje me interpretimin. Çdo laborator përdor kriteret e veta.

Sëmundja mund të zbulohet vetëm nga një mjek specialist bazuar në simptomat dhe rezultatet e testeve laboratorike. Testi Wester Blot nuk mund të interpretohet pa marrë parasysh simptomat.