Spis treści

GPM.1.7.2.0022.15 Oznaczanie autentyczności i czystości immunobiologicznych produktów leczniczych metodą Western blot

OGÓLNY ARTYKUŁ FARMAKOPEJSKI

Wprowadzony po raz pierwszy

Niniejsza ogólna monografia farmakopealna dotyczy metody Western blot, jednego z wariantów immunoblottingu, który służy do oceny autentyczności i czystości immunobiologicznych produktów leczniczych (IMP) opartych na wysoko oczyszczonych białkach, w tym także tych otrzymanych przy użyciu technologii rekombinacji DNA.

W pierwszym etapie przeprowadza się elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (tzw. elektroforeza SDS-PAGE) w celu rozdzielenia białek. Białka są następnie przenoszone na membranę nitrocelulozową lub membranę PVDF. Do detekcji stosuje się przeciwciała specyficzne dla wykrywanego białka, skoniugowane z fosfatazą alkaliczną lub peroksydazą chrzanową (bezpośrednia wersja testu ELISA) lub sekwencyjnie przy użyciu pierwszych przeciwciał przeciwko wykrywanemu białku i drugich przeciwciał (tzw. surowica antyglobulinowa ), pierwsze przeciwciała swoiste dla immunoglobulin, skoniugowane z fosfatazą alkaliczną lub peroksydazą chrzanową (pośrednia wersja testu ELISA).

W tym OFS opisano metodę wykrywania opartą na reakcji barwnej, jako jedną z najczęściej stosowanych obecnie. Do detekcji można również zastosować metody chemiluminescencyjne, w tym wzmocnioną chemiluminescencję oraz metody znaczników radioaktywnych lub fluorescencyjnych (RIA lub RIF).

Badanie przeprowadza się z substancjami farmaceutycznymi lub gotowymi produktami.

Podczas oceny autentyczności, na etapie elektroforezy, oprócz badanych próbek, do dołków żelowych należy dodać następujące roztwory: próbkę kontroli negatywnej (bufor do przygotowania próbki 1-krotny), mieszaninę markerów masy cząsteczkowej (zastosowanie zaleca się wstępnie wybarwione markery masy cząsteczkowej), standardową próbkę badanego białka (jeśli jest dostępna), certyfikowaną w zalecany sposób. Przy ocenie czystości (zanieczyszczeń) należy dodatkowo uwzględnić możliwość dodania próbki o stężeniu białka odpowiadającym granicy wykrywalności lub ilościowego oznaczenia zanieczyszczenia (w zależności od celu metody) i ustalonym na podstawie wyników metody walidacja. Oceniając czystość należy porównać wyniki blotu z wynikami elektroforezy w żelu poliakryloamidowym; technika powinna wykryć 1% zanieczyszczeń.

Metodologia

Aby rozdzielić białka według ich mas cząsteczkowych, najpierw przeprowadza się elektroforezę zgodnie z procedurą opisaną w Monografii Farmakopei Ogólnej „Elektroforeza w żelach poliakryloamidowych”.

Do przeprowadzenia transferu białek stosuje się urządzenie do transferu białek. Wszystkie prace wykonujemy w gumowych rękawiczkach. Objętość wszystkich stosowanych roztworów musi być wystarczająca do całkowitego zanurzenia membrany, na którą przenoszone są białka.

Po elektroforezie w celu przygotowania żelu do immunoblottingu, napełnia się go roztworem buforowym do transferu białka (o ile w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej nie wskazano inaczej), umieszcza na wytrząsarce orbitalnej i trzyma przez 10-15 minut. Następnie przygotowuje się arkusz nitrocelulozy lub membrany PVDF odpowiadający wielkości żelu. W przypadku stosowania membrany nitrocelulozowej arkusz przechowuje się przez 5 minut w wodzie dejonizowanej, a następnie przez 5 minut w roztworze buforowym do przenoszenia białka (o ile w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej nie wskazano inaczej). W przypadku stosowania membrany PVDF należy ją przechowywać w roztworze metanolu lub alkoholu przez 10-15 minut, a następnie wykonać te same czynności, co w przypadku membrany nitrocelulozowej.

Aby przenieść białka na membranę nitrocelulozową lub PVDF, składa się „kanapkę”. W tym celu specjalną gąbkę dołączoną do urządzenia do przenoszenia białek zwilża się roztworem buforu do przenoszenia białek i umieszcza na specjalnej plastikowej ramce, na której umieszcza się od jednego do trzech arkuszy bibuły filtracyjnej (na przykład Whatman 3MM), wstępnie przyciętej w celu dopasowania wielkość membrany i białka nasączone roztworem transferowym. Na wierzch nakłada się żel, na którego powierzchnię ostrożnie układa się przygotowany arkusz nitrocelulozy lub membrany PVDF (bez pęcherzyków powietrza). Na membranę umieszcza się od jednego do trzech arkuszy bibuły filtracyjnej zwilżonej roztworem do transferu białek i przykrywa drugą specjalną gąbką nasączoną roztworem do transferu białek. Ramkę mocuje się zaciskami i powoli zanurza w urządzeniu do elektroforezy wypełnionym roztworem do przenoszenia białek, arkuszem membrany skierowanym w stronę anody. Włącz urządzenie. Elektroforetyczny transfer białek przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 25 minut, ustalając granicę prądu na poziomie A max = 2 mA/cm 2 (przykładowo dla żelu o wymiarach 10 × 10 cm 2 A max = 200 mA), chyba że w artykule farmakopei lub dokumentacji regulacyjnej wskazano inaczej.

Dopuszcza się stosowanie sprzętu do półsuchego przenoszenia białek z żelu na membranę zgodnie z instrukcją jego stosowania.

Po zakończeniu transferu „kanapka” zostaje zdemontowana. Membranę przemywa się solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).

Kompletność transferu białka ocenia się wizualnie poprzez transfer kolorowych markerów masy cząsteczkowej, których wszystkie główne prążki białka powinny zostać wykryte na membranie.

Wykrycie

Aby wykryć wyniki metody Western blot, badany lek poddaje się działaniu (hybrydyzacji) przeciwciałami. W tym celu membranę z przeniesionymi na nią białkami umieszcza się w pojemniku z roztworem buforu blokującego i inkubuje na wytrząsarce orbitalnej przez 30–60 minut (o ile w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej nie określono inaczej), aby zapobiec niespecyficznej sorpcji przeciwciała na membranie.

Następnie przemyć membranę trzykrotnie w roztworze buforu płuczącego przez 5 minut, chyba że w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej określono inaczej.

Następnie membranę traktuje się roztworem pierwszych przeciwciał przeciwko analizowanemu białku, przygotowanym z użyciem roztworu buforowego dla przeciwciał (o ile w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej nie wskazano inaczej) bezpośrednio przed użyciem zgodnie z instrukcją użycia. Leczenie przeciwciałami przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 30–60 minut (o ile w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej nie wskazano inaczej).

Następnie membranę przemywa się trzykrotnie po 5 minut roztworem buforowym w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej, chyba że w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej wskazano inaczej.

Po przemyciu membrany przeprowadza się obróbkę (hybrydyzację) roztworem drugich przeciwciał. Jako drugie przeciwciała stosuje się przeciwciała poliklonalne przeciwko immunoglobulinom gatunku zwierząt, które wykorzystano do uzyskania pierwszych przeciwciał. Przeciwciała te są sprzężone z enzymem (peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną). Aby wykonać ten krok, powtórz procedurę opisaną powyżej, zastępując pierwszy roztwór przeciwciał drugim roztworem przeciwciał. Następnie membranę wypłukuje się z niezwiązanych drugich przeciwciał w sposób podobny do pierwszego.

Opracowanie wzoru immunoblot na membranie przeprowadza się za pomocą roztworu substratu tetrametylobenzydynowego (TMB) dla przeciwciał sprzężonych z peroksydazą chrzanową lub roztworu do wywołania fosfatazy alkalicznej – w przypadku stosowania przeciwciał sprzężonych z fosfatazą alkaliczną (o ile nie wskazano inaczej monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej).

Reakcję zatrzymuje się przez przemycie blotu wodą dejonizowaną. Nadmiar wody usuwa się z powierzchni membrany za pomocą bibuły filtracyjnej i suszy na powietrzu w ciemnym miejscu.

Ocena wyników

Oceniając autentyczność, główne kolorowe paski na wywołanej membranie powinny odpowiadać głównym kolorowym pasmom na elektroforogramie.

Ilość analizowanej substancji oraz zawartość zanieczyszczeń i ich stosunek ocenia się densytometrycznie.

Kryteria przydatności systemu

Wyniki metody Western blot można uwzględnić, jeśli:

• markery masy cząsteczkowej są rozmieszczone równomiernie na całej długości odpowiedniej ścieżki żelowej;
• blot pokazuje wszystkie główne prążki zidentyfikowane po zabarwieniu żelu jasnoniebieskim błękitem Coomassie R-250 lub G-250;
• zidentyfikowano próbkę o minimalnym stężeniu określonym w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej

Kryteria akceptacji wyników

• Dopasowanie blotu próbki badanej do blotu próbki referencyjnej, np. odpowiedniej próbki wzorcowej na bazie oczyszczonego białka (substancji);
• zgodność masy cząsteczkowej głównego zidentyfikowanego składnika z wymaganiami specyfikacji;
• zgodność zawartości wykrytych zanieczyszczeń w próbce wzorcowej z zakresem ustalonym w certyfikacie dla próbki wzorcowej.

Należy zastosować badanie Western blot tożsamości i czystości ze sprawdzonymi właściwościami walidacyjnymi w zakresie specyficzności i granicy wykrywalności zanieczyszczenia.

Cechy walidacji metod

Stosując metodologię oceny autentyczności, konieczne jest uzasadnienie kryteriów akceptowalności wyników; Wskazane jest użycie standardowej próbki na bazie oczyszczonego białka, certyfikowanej w zalecany sposób.

Stosując metodę oceny czystości, konieczne jest uzasadnienie granicy wykrywalności zanieczyszczenia. Dokonując oznaczenia ilościowego należy uzasadnić granicę ilościowego oznaczenia zanieczyszczenia, wskazać zakres liniowy przy oznaczaniu głównego składnika i zanieczyszczeń, precyzję i poprawność metody. W tym celu zaleca się użycie próbki wzorcowej na bazie oczyszczonego białka. W przypadku wprowadzenia zmian w metodzie określonej w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej należy potwierdzić właściwości walidacyjne wcześniej zatwierdzonej metody. Walidacji podlegają następujące zmiany:

• stosowanie różnej liczby próbek nanoszonych na żel;
• zmiana warunków przenoszenia białek z żelu na membranę, w tym zmiana stosowanego sprzętu;
• zmiany w składzie roztworów buforowych;
• zmiana metody wykrywania substancji badanej.

Notatki

1. Roztwór buforowy do przenoszenia białek pH 8,3. Jeżeli w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej nie ma innych instrukcji, należy zastosować jedną z metod przygotowania roztworów opisanych poniżej (patrz Opcja 1 i Opcja 2). Roztwór do transferu można zastosować 2-3 razy. Roztwór przechowuje się przez 6 miesięcy w temperaturze od 4 do 8 0 C.

Opcja 1. W zlewce miarowej o pojemności 3000 ml umieszcza się 7,86 g tris(hydroksymetylo)aminometanu, 33,75 g glicyny, dodaje się do 2400,0 ml wody dejonizowanej i miesza na mieszadle magnetycznym aż do całkowitego rozpuszczenia. Mierzy się pH, które powinno wynosić 8,3 - 8,4 (niedopuszczalne jest korygowanie pH roztworu kwasem lub zasadą). Dodać 600,0 ml alkoholu i wymieszać.

Opcja 2. Do zlewki miarowej o pojemności 1000 ml umieszcza się 5,8 g tris(hydroksymetylo)aminometanu, 2,9 g glicyny, 11,55 ml 10% roztworu dodecylosiarczanu sodu umieszcza się w zlewce miarowej o pojemności 1000 ml, dodaje 800,0 ml wody dejonizowanej i miesza na mieszadle magnetycznym do momentu uzyskania całkowite rozpuszczenie, mierzy się pH (8,3-8,4). Dodać 200,0 ml 100% metanolu i wymieszać. Jeśli stosuje się membranę PVDF, wówczas z roztworu buforowego wyklucza się dodecylosiarczan sodu, a ilość alkoholu zmniejsza się do 100,0 ml, zwiększając w ten sposób objętość dodanej wody do 900,0 ml.

1. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,2(o ile nie wskazano inaczej w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej). Do pojemnika z podziałką wlewa się 4500,0 ml wody dejonizowanej i dodaje kolejno: 40,0 g chlorku sodu, 1,0 g chlorku potasu, 5,75 g dwupodstawionego fosforanu sodu 2-wodnego, 1,0 g dipodstawionego fosforanu potasu (każdą kolejną sól dodaje się po całkowite rozwiązanie poprzedniego). Ustawić pH na 7,2 za pomocą 70% roztworu kwasu fosforowego lub 45% roztworu wodorotlenku sodu. Dostosuj objętość do 5000,0 ml za pomocą wody dejonizowanej. Roztwór filtruje się i przechowuje przez 3 miesiące w temperaturze 4–8 0 C.
2. Roztwór buforowy do płukania. Do kolby miarowej o pojemności 1000 ml dodać 5,0 ml 10% roztworu Tween-20, uzupełnić objętość roztworu do kreski za pomocą PBS i wymieszać. Roztwór przechowuje się przez 1 miesiąc w temperaturze od 4°C do 8°C.
3. Roztwór buforu blokującego. Do 100,0 ml roztworu buforowego do płukania dodać 5,0 mg albuminy surowicy bydlęcej (lub innego białka), o ile w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej nie wskazano inaczej, i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia. Roztwór przygotowuje się przed użyciem.
4. Roztwór buforowy przeciwciał. Do 100,0 ml roztworu buforowego do płukania dodać 2,0 mg albuminy surowicy bydlęcej (lub innych białek), o ile w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej nie wskazano inaczej, i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia. Roztwór przygotowuje się przed użyciem.

1. Rozwiązanie TMB— roztwór do rozwoju peroksydazy chrzanowej. Użyj podłoża TMB, gotowego do użycia.
2. Roztwór do wywoływania fosfatazy alkalicznej. Rozpuścić 1 tabletkę substratu BCIP/NBT w 10,0 ml wody dejonizowanej. Roztwór przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.

Są pospolite.

Wszystkie zachodnie metody inscenizacji składają się z następujących kroków:

1) przeniesienie białka z żelu na membranę;
2) blokowanie sorpcji niespecyficznej;
3) adsorpcja I-przeciwciał;
4) mycie;
5) adsorpcja przeciwciał II;
6) mycie;
7) rozwój filtrów;

Który rodzaj membrany zastosować: NC czy PVDV (podają, że ta druga jest bardziej wrażliwa) zależy tylko od Twojego gustu. Membrana NC jest bardziej delikatna, ale przy ostrożnej obsłudze nie jest to zauważalne.

Punkty.

To, czy przyciąć żel, pozostawiając tylko ten obszar, który chcesz zobaczyć na zdjęciu przed transferem, po transferze, czy w ogóle nie przycinać, zależy od chęci zaoszczędzenia błony i przeciwciał.

Można wykonać w kąpieli żelowej.

Ale lepiej nałożyć wszystko na raz, bez bąbelków.

Lub ~3mA na pojedynczy pasek.

Czasami przydatne jest oznaczenie położenia granic żelu, dołków itp.

Możesz kontrolować ilość białka pozostającą w żelu po transferze, barwiąc żel.

Hybrydyzacja.

Filtr powinien być zawsze wilgotny.

Wysuszoną membranę PVDF należy zwilżyć metanolem.

Strona P (do której nastąpiło przeniesienie) powinna stykać się z roztworem.

Hybrydyzację z a/t przeprowadza się w hybrydyzatorze w temperaturze 26 o C w małych cylindrach lub probówkach CF o pojemności 50 ml. Objętość roztworu hybrydyzacyjnego wynosi ~3ml (jak najmniejsza, ale tak, aby membrana nie wyschła).

Mycie i napełnianie: za pomocą NT, wytrząsanie w kąpieli (pokrywka od typów) V = 30-50ml.

Albo wyrzuć roztwór, albo przeprowadź w nim hybrydyzację, tylko nie kapaj stężonego a/t na filtr.

Do wypełniania niespecyficznych materiałów najlepiej zastosować mleko w proszku (BSA też jest możliwe, ale my mniej lubimy). Różne partie różnią się nieznacznie intensywnością tła.

Wlać roztwór hybrydyzacyjny do probówki CF o pojemności 50 ml, dodać wymaganą ilość a/t, wymieszać. Ułóż filtr wzdłuż ścianek probówki i umieść go w hybrydyzatorze.

Jeśli nie wiesz, przy jakim rozcieńczeniu działa a/ts, będziesz musiał to ustalić eksperymentalnie.

Czas interakcji z przeciwciałami można wydłużyć lub skrócić w zależności od przeciwciał.

Hybrydyzację przeprowadza się w 0,1-0,15M NaCl, spadek siły jonowej powoduje silną hybrydyzację niespecyficzną.

Bardzo ważne!!! Roztwór z przeciwciałami można stosować kilkukrotnie (5-7). Po użyciu wystarczy zamrozić w temperaturze -20 o C. Procedura ta sprawdza się przynajmniej dla buforu hybrydyzacyjnego: 1x PBS (bez Mg++/Ca++), 0,3-1,0% Mleko w proszku, Przeciwciała.

Podczas barwienia immunologicznego po immunoprecypitacji tło można usunąć poprzez wstępne koniugowanie przeciwciał wtórnych z przeciwciałami pierwotnymi.

Podana procedura nie jest jedyna. Opcje:

1. Całość robimy z NT na platformie wahadłowej, hybrydyzujemy i pakujemy do torebek foliowych (roztwór V ~1,5ml w zależności od wielkości filtra), myjemy w kąpieli:
1. nadzienie: 3% mleko w proszku, 1x PBS, 30-40";
2. „I”a/t: 1h 0,3% mleko w proszku, 1x PBS, surowica odpornościowa;
3. przemyć 3 razy x 5": 1x PBS, 0,05% Tween-20;
4. „II”a/t: 30” w 1x PBS;
5. mycie jak w kroku 3.

Pomimo znacznie niższej zawartości mleka w proszku w buforze hybrydyzacyjnym dla „I” a/t i jego całkowitego braku w buforze dla „II” a/t, metoda ta dała wyraźne obrazy. Najwyraźniej o sukcesie zadecydowała jakość używanych pojazdów.

2. Mycie i napełnianie odbywa się w wannie. Hybrydyzacja: na stole połóż kawałek parafilmu (większy niż membrana) i 0,5-1 ml roztworu hybrydyzacyjnego z dodatkiem a/t. Umieścić membranę stroną (P) skierowaną w stronę roztworu, unikając pęcherzyków, i przykryć górę kawałkiem parafilmu wielkości membrany. Inkubować 1 godz.

Metoda ta zmniejsza objętość mieszaniny hybrydyzacyjnej, ale może pogorszyć jakość hybrydyzacji.

Maksymalny blask występuje po 4-5 calach od nałożenia roztworu (rozsądna intensywność blasku utrzymuje się przez 15-20 cali).

Analiza Western blot w celu sprawdzenia ilości kalpastatyny obejmowała rozdzielenie białek tkankowych (30 μg na ścieżkę) metodą elektroforezy w 12% PAGE w obecności SDS (Laemmli, 1970), a następnie półsuche przeniesienie polipeptydów na membranę nitrocelulozową (Laemmli, 1970). bufor: 48 mM Tris-HCl, 39 mM glicyna, 0,0375% SDS, 20% metanol, pH 9,2). Po inkubacji (2 h, 20°C) membrany w buforze TBS (bufor 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5) niespecyficzne miejsca wiązania blokowano 5% roztworem odtłuszczonego mleka w buforze TBST (TBS z dodatkiem 0,1% Tween 20, pH 7,5) przez 1 h. Następnie membranę sekwencyjnie eksponowano na działanie poliklonalnych przeciwciał przeciwko kalpastatynie (rozcieńczenie 1:2500 w buforze TBST; 1 godzina) oraz przeciwciał przeciwko króliczej IgG skoniugowanej z peroksydazą ( rozcieńczenie 1: 2000 w buforze TBST, 1 godzina, 1 godzina); Każdy z tych etapów kończono przez wielokrotne przemywanie buforem TBST. Membranę poddano standardowej obróbce systemem Immune-Star (Bio-Rad, USA).

2.3.6 Inne metody

Stężenie białka frakcje oznaczono metodą Bradforda (Bradford, 1976), stosując jako standard albuminę surowicy bydlęcej (BSA).

Densytometria paski na zymogramach i kliszy rentgenowskiej wykonano przy użyciu standardowego programu „Image J”.

Przetwarzanie danych statystycznych przeprowadzono przy użyciu ogólnie przyjętych metod statystyki wariancyjnej z wykorzystaniem pakietów programów MS Excel i StatGraphics. Istotność różnic oceniano za pomocą nieparametrycznego testu U (test Wilcoxona-Manna-Whitneya) oraz jednoczynnikowej analizy wariancji (Korosov, Gorbach, 2007).

Rozdział 3. Wyniki badań i dyskusja

3.1. Układ kalpaina / kalpastatyna u szczurów poddanych neurodegeneracji wywołanej beta-amyloidem podczas terapii estrogenami

Neurodegenerację wywołano u szczurów rasy Wistar w starszych grupach wiekowych – 12 i 24 miesiące. Efekt eksperymentalny polegał na śródmózgowym podaniu 42-członowego fragmentu białka prekursorowego amyloidu – Abeta(1-42) (eksperymentalny model choroby Alzheimera), a także skojarzonym podaniu domózgowym peptydu beta-amyloidu z donosowym podaniem neuroprotektor (estradiol). Wśród zwierząt wyróżniono: grupę kontrolną – operowaną pozornie (2 µl roztworu soli w okolicy prawego hipokampa); pierwsza grupa eksperymentalna - 2 µl roztworu peptydu Abeta(1-42) (co odpowiada 5 µg peptydu) w okolicę prawego hipokampa; druga grupa doświadczalna – po podobnym wstrzyknięciu peptydu Abeta(1-42), codzienne donosowe podawanie 0,1 mg 17-beta-estradiolu.

Stwierdzono, że w obecności peptydu amyloidogennego w tkance nerwowej następuje aktywacja układu kalpainy, której stopień aktywacji dodatnio koreluje z intensywnością śmierci komórek tkanki nerwowej (gęstością neuronów). Regulacja kalpain może odbywać się zarówno na poziomie syntezy białka enzymatycznego (lub jego poszczególnych form - produktów różnych genów), jak i na poziomie potranslacyjnym w wyniku procesów autolizy, wiązania się z endogennym inhibitorem kalpastatyną lub do regulatora allosterycznego - wapnia.

Wzrost puli autolizowanych kalpain (118 kDa) wykryty za pomocą zymografii kazeinowej w grupie zwierząt nr 2 odzwierciedla aktywację kalpain in vivo. Obserwowana aktywacja m-kalpainy (120 kDa) najwyraźniej, podobnie jak w wielu innych sytuacjach, jest związana z nadmiarem wapnia w cytoplazmie. Kolejnym potwierdzeniem tej ścieżki regulacji aktywności kalpainy jest wykryty w naszych badaniach stabilny poziom jej inhibitora, kalpastatyny.

Jak się okazało, terapia estradiolem odwraca efekt hiperaktywacji kalpainy, zmniejszając się zarówno ogólna aktywność kalpainy w tkance nerwowej, jak i aktywność poszczególnych jej frakcji. W obecności estradiolu mniejsza część prekursora kalpainy ulega autolizie i w konsekwencji aktywacji. Konieczne są dalsze badania mechanizmu regulacji aktywności kalpainy u zwierząt doświadczalnych, w szczególności eksperymenty mające na celu ustalenie źródła nadmiaru wapnia i znalezienie środków zapobiegających tym patologicznym prądom.

Poziom syntezy proteasomów w tkance mózgowej jest niski w porównaniu do innych narządów i ma tendencję do zmniejszania się wraz z wiekiem (porównując wskaźniki u zwierząt 18, 24 i 30-miesięcznych), oceniając ilość alfa-1,2,3 Podjednostki proteasomu ,5,6,7 tworzące pierścienie alfa rdzenia cząstki 20S, uniwersalne dla proteasomów 20S i 26S.

Potwierdzono zmiany w poziomie ekspresji i aktywności katepsyn w różnych obszarach mózgu zwierząt doświadczalnych. W naszym eksperymencie śródmózgowe podanie peptydu beta-amyloidu doprowadziło do znacznego wzrostu (str<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Nasze dane wykazały znaczący wpływ beta-amyloidu i estradiolu na funkcje poznawcze u szczurów oceniane za pomocą labiryntu wodnego Morrisa. U wcześniej trenowanych samic i samców szczurów, po wstrzyknięciu peptydu beta-amyloidu do hipokampa, zaobserwowano znaczącą (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Wyniki mikroskopii konfokalnej skrawków mózgu wykazały, że podawanie peptydu beta-amyloidowego prowadzi do istotnego wzrostu poziomu jego immunoreaktywności w tkankach zarówno prawej, jak i w mniejszym stopniu lewej półkuli mózgu. Wyniki te, wraz z danymi behawioralnymi, wykazują skuteczność podanego leku peptydu amyloidowego i dostarczają dowodów na reprezentatywność wybranego modelu choroby Alzheimera. Późniejsze podanie estradiolu zmniejszyło ilość beta-amyloidu w mózgach szczurów do poziomu prawie kontrolnego. Redukcja złogów amyloidu u szczurów leczonych estradiolem wskazuje na uruchomienie w tkance nerwowej pewnych procesów adaptacyjnych mających na celu ich wykorzystanie.

Mechanizm neuroprotekcyjnego działania estradiolu nie jest jeszcze w pełni poznany, chociaż zjawisko to obserwuje się już od dawna. Stosowanie estradiolu jako neuroprotektora jest podyktowane kilkoma względami. Po pierwsze, neuroprotekcyjne działanie estradiolu jest dość dobrze znane i opisane w literaturze (McEwen i in., 2001; Asimiadou i in., 2005; Lebesgue i in., 2009). Po drugie, wykazano, że estradiol jest neurosteroidem w pełnym tego słowa znaczeniu, gdyż w mózgu znajdują się wszystkie enzymy niezbędne do jego syntezy (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). Po trzecie, wiadomo, że neuroprotekcyjne działanie estradiolu jest związane z jego działaniem przeciwutleniającym (Behl i in., 1997) i antyapoptotycznym (Asimiadou i in., 2005), czyli z działaniem odwrotnym do działania peptydu Abeta.

Uzyskane wyniki mogą wskazywać na odpowiedź adaptacyjną tkanki nerwowej na wprowadzenie toksycznego peptydu. Niektóre publikacje wskazują, że w degradację peptydu beta-amyloidu może brać udział lizosomalny układ autofagii (Nixon, 2007). Jest prawdopodobne, że estradiol stymuluje autofagię materiału białkowego; Świadczą o tym zarówno dane dotyczące zawartości peptydu Abeta w tkance mózgowej, jak i ocena aktywności i poziomu ekspresji proteinaz lizosomalnych. Fluorescencyjna immunohistochemia ujawniła zmniejszenie ilości beta peptydu u szczurów otrzymujących terapię neuroprotekcyjną estradiolem.

Na podstawie danych uzyskanych w eksperymencie można wyciągnąć następujące wnioski. 1. Poziom ekspresji genów proteinaz lizosomalnych CtsD, CtsB, CtsL i podjednostek alfa proteasomów oraz aktywność kodowanych przez nie enzymów w korze mózgowej szczurów zmniejsza się wraz z wiekiem. Przeciwnie, aktywność kalpain u zwierząt starszych grup wiekowych wzrasta. 2. Poziom ekspresji i aktywności katepsyny D, a także intensywność proteolizy zależnej od wapnia, znacznie wzrastają w hipokampie i korze mózgowej szczurów po śródmózgowym podaniu peptydu beta-amyloidu, co pogarsza funkcje poznawcze zwierząt . 3. Podawanie estradiolu na tle zatrucia beta-amyloidem prowadzi do zmniejszenia zawartości tego peptydu w hipokampie szczurów oraz poprawy wskaźników biochemicznych i behawioralnych u zwierząt doświadczalnych. 4. Farmakologiczna aktywacja funkcji lizosomów przez estrogeny może sprzyjać usuwaniu Abeta w chorobie Alzheimera; normalizacja homeostazy wapnia w tej sytuacji zapobiega patologicznej aktywacji układu kalpainy i jednocześnie utracie neuronów na zależnych od kalpainy szlakach śmierci komórkowej.

W praktyce diagnostyki laboratoryjnej chorób zakaźnych czasami zachodzi potrzeba oznaczenia przeciwciał nie przeciwko patogenowi w ogóle, ale niektórym jego białkom (antygenom), czyli spektrum specyficznych przeciwciał. Jeżeli w tym celu stosuje się metodę enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego, wówczas w tym przypadku konieczne jest wcześniejsze wyizolowanie i oczyszczenie niezbędnych antygenów z hodowli patogenu. Powstałe białka nanosi się oddzielnie na fazę stałą. W przypadku stosowania płytki 96-dołkowej, w każdym dołku umieszcza się jeden rodzaj antygenu. Następnie metodą pośrednią oznacza się swoiste przeciwciała.

Na podstawie obecności w dołku pozytywnej reakcji z określonym antygenem można ocenić obecność odpowiednich specyficznych przeciwciał. Tego typu systemy do testów immunoenzymatycznych są oferowane przez firmy produkcyjne, jednak metoda immunoblottingu (Western blot) stała się powszechna ze względu na większą zawartość informacyjną i łatwość przeprowadzenia samego badania.

Immunoblotting pozwala na jednoczesne i zróżnicowane oznaczenie przeciwciał w surowicy krwi na wszystkie istotne diagnostycznie białka patogenu. Tłumaczenie z angielskiego Western blot oznacza transfer western (dosłownie - blotting). Historia tego niezwykłego terminu jest następująca.

W 1975 roku naukowiec E. Southern jako pierwszy zaproponował metodę przenoszenia rozdzielonych elektroforetycznie fragmentów DNA z żelu na membranę. Według autora metodę tę nazwano Southern blot, co w tłumaczeniu oznacza „transfer południowy”. Z kolei metodę przenoszenia cząsteczek RNA eksperci nazwali Northern blot - „transferem północnym”. Początkowo jako żart, a potem nazwa ta utrwaliła się w oficjalnej literaturze naukowej.

W 1979 r. G. Towbin opublikował wyniki pierwszych eksperymentów z metodą blottingu białek. Kontynuując tradycję nadawania „geograficznych” nazw metodom przenoszenia makrocząsteczek biologicznych, metodę tę zaczęto nazywać transferem „zachodnim” – Western blot.

Pierwszy etap tej metody polega na elektroforetycznym rozdzieleniu mieszaniny białek patogenu w żelu poliakryloamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS). SDS, będący środkiem powierzchniowo czynnym, równomiernie otacza cząsteczki białka i nadaje im ładunek ujemny o w przybliżeniu równej wielkości. Dlatego cząsteczki poruszają się w polu elektrycznym w jednym kierunku, a prędkość ruchu zależy tylko od wielkości cząsteczki (masy cząsteczkowej) białka.

W wyniku zabiegu elektroforetycznego otrzymuje się płytkę żelową, w grubości której białka rozmieszczone są w postaci odrębnych, cienkich stref liniowych. Ze względu na kierunek ruchu dzieli się je w następującej kolejności: bliżej początku znajdują się białka o dużej masie cząsteczkowej, około 120-150 kDa, a najdalej do mety przesunęły się białka o masie 5-10 kDa linia. W drugim etapie płytkę żelową umieszcza się na arkuszu nitrocelulozy, a strukturę tę umieszcza się pomiędzy elektrodami źródła prądu stałego. Pod wpływem pola elektrycznego białka przepływają z porowatego żelu do gęstszej membrany, gdzie są trwale osadzone.

Powstały blot traktuje się roztworem blokującym zawierającym antygenowo obojętne białka i/lub niejonowe detergenty (Tween 20), które blokują miejsca na membranie wolne od antygenu. Następnie arkusz membrany kroi się na wąskie paski, tak aby każdy pasek zawierał wszystkie frakcje antygenowe. Opisane kroki są wykonywane przez producenta.

Komercyjne systemy testowe do oznaczania przeciwciał za pomocą immunoblottingu zawierają plamy (paski lub paski), które są gotowe do badania. Użytkownik oznacza całe spektrum swoistych przeciwciał przeciwko białkom patogenu metodą pośrednią. Rozpuszczalna bezbarwna substancja służy jako chromogen do przeprowadzenia barwnej (enzymatycznej) reakcji, której produkt nabiera koloru, staje się nierozpuszczalny i osadza się (wytrąca się) na nitrocelulozie.

W wyniku kolejnych reakcji immunologicznych i enzymatycznych, w obecności przeciwciał przeciwko białkom patogenu w badanej próbce, na plamie pojawiają się ciemne poprzeczne paski, których lokalizacja znajduje się w strefie określonych białek patogenu. Każdy taki prążek wskazuje na obecność specyficznych przeciwciał przeciwko odpowiedniemu antygenowi. Wynik badania metodą immunoblottingu podawany jest w postaci listy przeciwciał skierowanych przeciwko konkretnym białkom patogenu. Na przykład: „wykryto przeciwciała przeciwko białkom p17 i p24”.

Bloty nitrocelulozowe można przechowywać w stanie suchym przez długi czas po wywołaniu. Jednak intensywność koloru znacznie słabnie. Mokre plamy można fotografować lub ich graficzne obrazy wprowadzać do pamięci komputerów osobistych za pomocą skanerów. Specjalne programy komputerowe umożliwiają obróbkę wyników i szybkie monitorowanie dynamiki widma przeciwciał podczas obserwacji dynamicznej

Western blot to metoda wyszukiwania specyficznych przeciwciał przeciwko bakteriom wywołującym boreliozę. Co to jest test Western blot? Jak interpretować wyniki badania?

Western blotting to test wykrywający przeciwciała wytwarzane przez organizm przeciwko bakteriom wywołującym boreliozę. Na powierzchni bakterii znajdują się antygeny, przeciwko którym organizm posiada swoiste przeciwciała w klasach IgM i IgG. IgM.

Immunoglobulina M (IgM) – wytwarzana podczas pierwszego kontaktu naszego organizmu z danym patogenem. Wzrost ilości IgM przeciwko danemu patogenowi wskazuje na początek procesu chorobowego.

Immunoglobulina G (IgG) organizm wytwarza po IgM, najwyższy poziom osiąga po około sześciu miesiącach od zakażenia i w przeciwieństwie do IgM, przeciwciała mogą utrzymywać się we krwi przez bardzo długi czas, nawet kilka lat.

Test Western Blot – wskazania do wykonania

Western blot stosuje się w drugim etapie diagnozowania boreliozy – gdy test ELISA (pierwszy test) daje wynik pozytywny lub niejednoznaczny. Nie stosuje się go jednak, gdy wynik testu ELISA jest wyraźnie negatywny.

Western blot – na czym polega badanie?

Test Western Blot na boreliozę (chorobę z Lyme) dokładnie ocenia przeciwciała przeciwko różnym fragmentom bakterii. Różne przeciwciała
względem poszczególnych fragmentów bakterii są graficznie odzwierciedlone w postaci czarnych pasków na papierze nitrocelulozowym.

1. Do wykonania badania wymagane są dwa główne elementy: surowica krwi pacjenta oraz wyhodowana zabita i rozdrobniona bakteria boreliozy.

Nie wykonuj tego testu wkrótce po ukąszeniu kleszcza. Poczekaj co najmniej 4 tygodnie. Koszt badania Western Blot w obu klasach przeciwciał wynosi około 2500-5000 rubli.

2. Pod wpływem prądu elektrycznego następuje rozkład na czynniki, przede wszystkim bakterie pochodzące z hodowli komórkowej, w tym białka bakteryjne (antygeny). Białka te są następnie przenoszone na membranę nitrocelulozową. Membrana jest cięta na paski.

3. Pasek antygenowy w połączeniu z surowicą krwi pacjenta barwi się specjalną techniką, która wykrywa przeciwciała specyficznie związane z antygenami Sprechete Borrelia.

4. W miejscach, w których przeciwciała pacjenta wiążą się z białkami (antygenami) bakterii boreliozy, zauważamy charakterystyczne paski (wskazujące na zakażenie bakterią z Lyme). Wynik testu jest pozytywny.

Każdy prążek odpowiada białku bakteryjnemu (antygenowi). Jeśli białka i przeciwciała komórek boreliozy nie połączą się, prążek nie pojawi się. Wtedy wynik jest negatywny.

Test Western Blot – kiedy warto go wykonać?

Wczesne rozpoznanie boreliozy jest problematyczne ze względu na tzw. okno serologiczne. Jest to okres od początku infekcji do rozpoczęcia wytwarzania przez organizm wykrywalnych przeciwciał. W przypadku boreliozy okno serologiczne trwa średnio 4 tygodnie.

Wykonanie badań w czasie krótszym niż 4 tygodnie od ukąszenia przez kleszcza wiąże się z ryzykiem uzyskania wyniku fałszywie ujemnego.

Test Western Blot - wynik pozytywny

Posiadanie przeciwciał przeciwko Borrelia oznacza, że ​​masz boreliozę. Trudno jednak odpowiedzieć na pytanie, czy infekcja jest aktywna, czy nie.

Przeciwciała IgG powstałe w wyniku infekcji można wykryć we krwi nawet 10, a czasami 20 lat od rozpoznania boreliozy.

Zdarza się również, że wykryte przeciwciała IgM (zwykle uważane za aktywny marker infekcji) mogą być trwałe i również nie wskazywać na aktywną infekcję.

Test Western Blot - wynik negatywny

Test może dać wynik negatywny w początkowym okresie choroby, tj. W pierwszych tygodniach po ukąszeniu.

Test Western blot można wykonać nie tylko w przypadku podejrzenia boreliozy, ale także w przypadku zakażenia H. pylori (powodującego wrzody trawienne) lub HIV.

Test Western blot może dać fałszywie ujemny wynik również w innej sytuacji - gdy w starej przewlekłej boreliozie ustało wytwarzanie przeciwciał lub gdy przeciwciała uległy całkowitemu zużyciu w walce z tą chorobą.

Jeżeli podejrzenie boreliozy jest mocne, badanie Western Blot należy powtórzyć kilkukrotnie, na przykład co kilka tygodni, aż do momentu, w którym we krwi pojawią się przeciwciała.

Obecność przeciwciał w aktywnej chorobie z Lyme jest różna, a osoba, która uzyska wynik negatywny, ma szansę uzyskać pozytywny wynik testu, gdy ponownie wykona test kilka tygodni później. Czasami diagnoza zostaje potwierdzona dopiero po czwartym lub piątym razem.

W takim przypadku niektórzy lekarze próbują uzyskać potwierdzenie infekcji w inny sposób: leczą pacjenta antybiotykami przez kilka tygodni, a po 5-6 tygodniach wysyłają go na badanie Western blotting.

Leczenie antybiotykami przez taki czas nie wyleczy choroby przewlekłej, ale zmieni układ odpornościowy na tyle, że we krwi będzie wystarczająca ilość przeciwciał, aby można je było wykryć. Wynik testu Western blot musi interpretować lekarz specjalizujący się w leczeniu boreliozy

Test WB można również wykonać w trakcie terapii przeciwbakteryjnej, jednak w przypadku antybiotyków prawdopodobieństwo uzyskania wyniku pozytywnego jest nieco mniejsze. Za pomocą tego testu najłatwiej zdiagnozować chorobę po 6 tygodniach od zaprzestania antybiotykoterapii.

Ważny

Interpretacja badania jest interpretacją pasm. Generalnie należy przyjąć, że im więcej prążków, tym wiarygodniejsza diagnoza. Trzy paski to naprawdę duża pewność, a 5-6 pasków oznacza boreliozę z niemal 100% prawdopodobieństwem.

Prążki IgM mają większą wartość diagnostyczną, ponieważ sugerują aktywną fazę boreliozy przenoszonej przez kleszcze, chociaż wykryte przeciwciała w klasie IgM (prążki IgM) mogą być trwałe i nie wskazywać na aktywną infekcję. Okazuje się, że IgM jest wysokie na początku infekcji i wbrew logice w przewlekłej boreliozie.

Podwyższony poziom przeciwciał IgG można uznać za infekcję resztkową lub może wskazywać na przewlekłą, aktywną chorobę.

Nawet ujemny wynik testu nie oznacza, że ​​borelioza nie występuje. Ujemny wynik testu oznacza jedynie, że we krwi nie ma przeciwciał przeciwko bakteriom boreliozy – może to nastąpić np. wtedy, gdy bakterie przedostały się do organizmu, a produkcja przeciwciał jeszcze się nie rozpoczęła (lekarze nazywają ten okres oknem serologicznym).

Ze względu na różnorodność metod stosowanych w badaniu trudno jest sformułować uniwersalne zalecenia interpretacyjne. Każde laboratorium stosuje własne kryteria.

Chorobę może wykryć jedynie lekarz specjalista na podstawie objawów i wyników badań laboratoryjnych. Testu Wester Blot nie można interpretować bez uwzględnienia objawów.