Sommario

GPM.1.7.2.0022.15 Determinazione dell'autenticità e della purezza dei medicinali immunobiologici mediante il metodo Western blot

ARTICOLO GENERALE FARMACOPEO

Presentato per la prima volta

Questa monografia generale della farmacopea si applica al metodo Western blot, una delle varianti dell'immunoblotting, che viene utilizzato per valutare l'autenticità e la purezza dei medicinali immunobiologici (IMP) a base di proteine ​​altamente purificate, compresi quelli ottenuti utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante.

Nella prima fase, l'elettroforesi viene eseguita in gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato (la cosiddetta elettroforesi SDS-PAGE) per separare le proteine. Le proteine ​​vengono quindi trasferite su una membrana di nitrocellulosa o membrana in PVDF. Il rilevamento viene effettuato utilizzando anticorpi specifici per la proteina da rilevare, coniugati con fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano (versione diretta di ELISA), oppure utilizzando sequenzialmente i primi anticorpi contro la proteina da rilevare e i secondi anticorpi (il cosiddetto siero antiglobulina ), i primi anticorpi specifici per le immunoglobuline, coniugati con fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano (versione indiretta dell'ELISA).

Questo OFS descrive un metodo di rilevamento basato su una reazione cromatica, come uno dei più utilizzati attualmente. Per il rilevamento possono essere utilizzati anche metodi chemiluminescenti, compresa la chemiluminescenza potenziata, e metodi di marcatori radioattivi o fluorescenti (RIA o RIF).

Il test viene effettuato con sostanze farmaceutiche o prodotti finiti.

Quando si valuta l'autenticità, nella fase dell'elettroforesi, oltre ai campioni testati, è necessario aggiungere ai pozzetti del gel le seguenti soluzioni: un campione di controllo negativo (1 volta tampone di preparazione del campione), una miscela di marcatori di peso molecolare (l'uso di si consigliano marcatori di peso molecolare precolorati), un campione standard della proteina da testare (se disponibile), certificato secondo le modalità prescritte. Quando si valuta la purezza (impurezze), è necessario prevedere disposizioni aggiuntive per l'aggiunta di un campione con una concentrazione proteica corrispondente al limite di rilevamento o quantificazione dell'impurezza (a seconda dello scopo del metodo) e stabilita in base ai risultati del metodo convalida. Quando si valuta la purezza, è necessario confrontare i risultati del blot con i risultati dell'elettroforesi su gel di poliacrilammide; la tecnica dovrebbe rilevare l'1% di impurità.

Metodologia

Per separare le proteine ​​in base al loro peso molecolare, si esegue prima l’elettroforesi secondo la procedura descritta nella Monografia della Farmacopea Generale “Elettroforesi in gel di poliacrilammide”.

Per effettuare il trasferimento delle proteine, viene utilizzato un dispositivo di trasferimento delle proteine. Tutto il lavoro viene eseguito utilizzando guanti di gomma. Il volume di tutte le soluzioni utilizzate deve essere sufficiente ad immergere completamente la membrana su cui vengono trasferite le proteine.

Dopo l'elettroforesi per preparare il gel per l'immunoblotting, questo viene riempito con una soluzione tampone per il trasferimento delle proteine ​​(salvo diversa indicazione nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa), posto su un agitatore orbitale e conservato per 10-15 minuti. Viene quindi preparato un foglio di membrana di nitrocellulosa o PVDF corrispondente alla dimensione del gel. Quando si utilizza una membrana di nitrocellulosa, il foglio viene mantenuto per 5 minuti in acqua deionizzata, quindi 5 minuti in una soluzione tampone per il trasferimento delle proteine ​​(salvo diversa indicazione nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa). Quando si utilizza una membrana in PVDF, è necessario mantenerla in una soluzione di metanolo o alcool per 10-15 minuti, quindi eseguire gli stessi passaggi di una membrana di nitrocellulosa.

Per trasferire le proteine ​​su una membrana di nitrocellulosa o PVDF, viene assemblato un “sandwich”. Per fare ciò, una spugna speciale inclusa con il dispositivo di trasferimento delle proteine ​​viene inumidita con una soluzione tampone di trasferimento delle proteine ​​e posizionata su uno speciale telaio di plastica, su cui vengono posizionati da uno a tre fogli di carta da filtro (ad esempio, Whatman 3MM), pretagliati per adattarsi la dimensione della membrana e le proteine ​​imbevute nella soluzione di trasferimento. Sopra viene posto un gel, sulla cui superficie viene accuratamente posizionato un foglio preparato di membrana di nitrocellulosa o PVDF (senza bolle d'aria). Sulla membrana vengono posti da uno a tre fogli di carta da filtro, pre-inumiditi in una soluzione di trasferimento delle proteine, e ricoperti sopra con una seconda spugna speciale imbevuta di una soluzione di trasferimento delle proteine. Il telaio viene fissato con morsetti e immerso lentamente in un dispositivo per elettroforesi riempito con una soluzione di trasferimento proteico, con il foglio di membrana rivolto verso l'anodo. Accendi il dispositivo. Il trasferimento elettroforetico delle proteine ​​viene effettuato a temperatura ambiente per 25 minuti, impostando il limite di corrente alla velocità di A max = 2 mA/cm 2 (ad esempio, per un gel che misura 10 × 10 cm 2 A max = 200 mA), salvo diversa indicazione nell'articolo di farmacopea o nella documentazione normativa.

È consentito utilizzare l'attrezzatura per il trasferimento semisecco delle proteine ​​dal gel alla membrana secondo le istruzioni per l'uso.

Al termine del trasferimento, il “sandwich” viene smontato. La membrana viene lavata con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).

La completezza del trasferimento delle proteine ​​viene valutata visivamente mediante il trasferimento di marcatori colorati del peso molecolare, tutte le principali bande proteiche dei quali dovrebbero essere rilevate sulla membrana.

Rilevamento

Per rilevare i risultati del metodo Western blot, il farmaco in esame viene trattato (ibridato) con anticorpi. Per fare ciò, la membrana con le proteine ​​trasferite su di essa viene posta in un contenitore con una soluzione tampone bloccante e incubata su un agitatore orbitale per 30-60 minuti (se non diversamente previsto nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa) per prevenire l'assorbimento aspecifico di anticorpi sulla membrana.

Successivamente, lavare la membrana in una soluzione tampone di lavaggio tre volte per 5 minuti, se non diversamente specificato nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa.

Quindi la membrana viene trattata con una soluzione dei primi anticorpi contro la proteina da analizzare, preparata utilizzando una soluzione tampone per anticorpi (se non diversamente indicato nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa) immediatamente prima dell'uso secondo le istruzioni per l'uso. Il trattamento con gli anticorpi viene effettuato a temperatura ambiente per 30–60 minuti (salvo diversa indicazione nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa).

Successivamente, la membrana viene lavata tre volte per 5 minuti con una soluzione tampone per rimuovere gli anticorpi non legati su un agitatore orbitale a temperatura ambiente, se non diversamente indicato nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa.

Dopo aver lavato la membrana, si effettua il trattamento (ibridazione) con una soluzione di secondi anticorpi. Come secondi anticorpi vengono utilizzati anticorpi policlonali contro le immunoglobuline delle specie animali utilizzate per ottenere i primi anticorpi. Questi anticorpi sono coniugati ad un enzima (perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina). Per eseguire questo passaggio ripetere la procedura sopra descritta, sostituendo la prima soluzione anticorpale con una seconda soluzione anticorpale. Quindi la membrana viene lavata dai secondi anticorpi non legati in modo simile al primo.

Lo sviluppo del pattern immunoblot sulla membrana viene effettuato con una soluzione di substrato di tetrametilbenzidina (TMB) per anticorpi coniugati con perossidasi di rafano, o una soluzione per lo sviluppo di fosfatasi alcalina - quando si utilizzano anticorpi coniugati con fosfatasi alcalina (se non diversamente indicato nella la monografia della farmacopea o la documentazione normativa).

La reazione viene interrotta lavando la macchia con acqua deionizzata. L'acqua in eccesso viene rimossa dalla superficie della membrana con carta da filtro ed essiccata all'aria in un luogo buio.

Valutazione dei risultati

Nel valutare l'autenticità, le principali bande colorate sulla membrana sviluppata dovrebbero corrispondere alle principali bande colorate sull'elettroferogramma.

La quantità della sostanza analizzata e il contenuto di impurità, nonché il loro rapporto, vengono valutati densitometricamente.

Criteri di idoneità del sistema

I risultati del metodo Western blot possono essere presi in considerazione se:

• i marcatori del peso molecolare sono distribuiti uniformemente lungo l'intera lunghezza della corrispondente traccia del gel;
• la macchia mostra tutte le bande principali identificate quando il gel è colorato con Coomassie bright blue R-250 o G-250;
• viene identificato un campione con la concentrazione minima stabilita nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa

Criteri di accettazione dei risultati

• Corrispondenza del blot del campione in esame con il blot del campione di riferimento, ad esempio il corrispondente campione standard a base di proteina purificata (sostanza);
• conformità del peso molecolare del principale componente identificato ai requisiti di specifica;
• conformità del contenuto dell'impurezza rilevata nel campione standard con l'intervallo stabilito nel certificato per il campione standard.

Il test Western blot di identità e purezza dovrebbe essere utilizzato con caratteristiche di validazione comprovate per la specificità e il limite di rilevamento dell'impurezza.

Caratteristiche della validazione del metodo

Quando si utilizza una metodologia per valutare l'autenticità, è necessario giustificare i criteri di accettabilità dei risultati; Si consiglia di utilizzare un campione standard a base di proteine ​​purificate, certificato secondo le modalità prescritte.

Quando si utilizza un metodo per valutare la purezza, è necessario giustificare il limite di rilevamento dell'impurezza. Quando si effettua una determinazione quantitativa, è necessario giustificare il limite di determinazione quantitativa di un'impurezza, indicare l'intervallo lineare quando si determina il componente principale e le impurità, la precisione e la correttezza del metodo. A questo scopo è consigliabile utilizzare un campione standard a base di proteine ​​purificate. Quando vengono apportate modifiche al metodo specificato nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa, devono essere confermate le caratteristiche di validazione del metodo precedentemente approvato. Le seguenti modifiche sono soggette a convalida:

• l'uso di diversi numeri di campioni applicati al gel;
• modificare le condizioni di trasferimento delle proteine ​​dal gel alla membrana, compresa la modifica dell'attrezzatura utilizzata;
• cambiamenti nella composizione delle soluzioni tampone;
• modifica del metodo di rilevamento della sostanza in esame.

Appunti

1. Soluzione tampone per trasferimento proteine ​​pH 8,3. Se non ci sono altre istruzioni nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa, utilizzare uno dei metodi per preparare le soluzioni descritti di seguito (vedere Opzione 1 e Opzione 2). La soluzione di trasferimento può essere utilizzata 2-3 volte. La soluzione viene conservata per 6 mesi a una temperatura compresa tra 4 e 8 0 C.

Opzione 1. In un bicchiere graduato della capacità di 3000 ml si pongono 7,86 g di tris(idrossimetil)amminometano, 33,75 g di glicina, si aggiungono fino a 2400,0 ml di acqua deionizzata e si agita su agitatore magnetico fino a completa dissoluzione. Viene misurato il pH, che dovrebbe essere pari a 8,3 - 8,4 (non è consentito regolare il pH della soluzione con acidi o alcali). Aggiungere 600,0 ml di alcool e mescolare.

Opzione 2. In un bicchiere tarato della capacità di 1000 ml si pongono 5,8 g di tris(idrossimetil)amminometano, 2,9 g di glicina, 11,55 ml di soluzione di sodio dodecil solfato al 10%, si aggiungono 800,0 ml di acqua deionizzata e si agita su agitatore magnetico fino a quando completa dissoluzione, si misura il pH (8,3-8,4). Aggiungere 200,0 ml di metanolo al 100% e mescolare. Se viene utilizzata una membrana in PVDF, il sodio dodecil solfato viene escluso dalla soluzione tampone e la quantità di alcol viene ridotta a 100,0 ml, aumentando così il volume di acqua aggiunta a 900,0 ml.

1. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2(salvo diversa indicazione nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa). In un contenitore graduato si versano 4500,0 ml di acqua deionizzata e si aggiungono successivamente: 40,0 g di cloruro di sodio, 1,0 g di cloruro di potassio, 5,75 g di fosfato di sodio disostituito 2-acquoso, 1,0 g di fosfato di potassio disostituito (ogni sale successivo viene aggiunto dopo completo scioglimento del precedente). Impostare il pH su 7,2 con una soluzione di acido fosforico al 70% o una soluzione di idrossido di sodio al 45%. Regolare il volume a 5000,0 ml con acqua deionizzata. La soluzione viene filtrata e conservata per 3 mesi a una temperatura di 4 - 8 0 C.
2. Soluzione tampone per il lavaggio. Aggiungere 5,0 ml di una soluzione di Tween-20 al 10% in un matraccio tarato da 1000 ml, regolare il volume della soluzione fino alla tacca utilizzando PBS e mescolare. La soluzione viene conservata per 1 mese a una temperatura compresa tra 4 °C e 8 °C.
3. Soluzione tampone bloccante. A 100,0 ml di soluzione tampone per lavaggio, aggiungere 5,0 mg di albumina sierica bovina (o altra proteina), se non diversamente indicato nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa, e mescolare fino a completa dissoluzione. La soluzione viene preparata prima dell'uso.
4. Soluzione tampone anticorpale. A 100,0 ml di soluzione tampone per lavaggio, aggiungere 2,0 mg di albumina sierica bovina (o altre proteine), se non diversamente indicato nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa, e mescolare fino a completa dissoluzione. La soluzione viene preparata prima dell'uso.

1. Soluzione TMB— soluzione per lo sviluppo della perossidasi di rafano. Utilizzare il substrato TMB, pronto all'uso.
2. Soluzione per lo sviluppo della fosfatasi alcalina. Sciogliere 1 compressa di substrato BCIP/NBT in 10,0 ml di acqua deionizzata. La soluzione viene preparata immediatamente prima dell'uso.

Sono comuni.

Tutti i metodi di stadiazione occidentali consistono nei seguenti passaggi:

1) trasferimento delle proteine ​​dal gel alla membrana;
2) bloccare l'assorbimento non specifico;
3) adsorbimento degli anticorpi I;
4) lavaggio;
5) adsorbimento degli anticorpi II;
6) lavaggio;
7) sviluppo del filtro;

Che tipo di membrana utilizzare: NC o PVDV (dicono che quest'ultima sia più sensibile) dipende solo dai vostri gusti. La membrana NC è più fragile, ma con un utilizzo attento ciò non si nota.

I punti.

Se tagliare il gel, lasciando solo l'area che si desidera vedere nell'immagine prima del trasferimento, dopo il trasferimento, o non tagliarlo affatto, dipende dal desiderio di risparmiare membrana e anticorpi.

Può essere fatto in un bagno di gel.

Ma è meglio applicare tutto in una volta senza bolle.

Oppure ~3 mA per singola striscia.

A volte è utile contrassegnare la posizione dei confini del gel, dei pozzetti, ecc.

Puoi controllare la quantità di proteine ​​rimaste nel gel dopo il trasferimento colorando il gel.

Ibridazione.

Il filtro dovrebbe essere sempre bagnato.

La membrana in PVDF essiccata deve essere bagnata con metanolo.

Il lato P (verso il quale è avvenuto il trasferimento) dovrebbe essere in contatto con la soluzione.

L'ibridazione con a/t viene effettuata in un ibridatore a 26 oC in piccoli cilindri o provette CF da 50 ml. Il volume della soluzione di ibridazione è di ~3 ml (il minimo possibile, ma in modo che la membrana non si secchi).

Lavaggio e riempimento: con NT, agitazione in bagno (coperchio da tipi) V = 30-50ml.

Gettare via la soluzione o effettuare l'ibridazione in essa, basta non gocciolare concentrato sul filtro.

Per il riempimento di materiali non specifici è meglio usare il latte in polvere (è possibile anche il BSA, ma a noi piace di meno). Diversi lotti differiscono leggermente nell'intensità dello sfondo.

Versare la soluzione di ibridazione in una provetta CF da 50 ml, aggiungere la quantità necessaria di a/t, mescolare. Appoggia il filtro lungo la parete della provetta e posizionalo nell'ibridatore.

Se non sai a quale diluizione funziona l'a/ts, dovrai determinarlo sperimentalmente.

Il tempo di interazione con gli anticorpi può essere aumentato o diminuito a seconda degli anticorpi.

L'ibridazione viene effettuata in NaCl 0,1-0,15 M; una diminuzione della forza ionica provoca una forte ibridazione non specifica.

Molto importante!!! La soluzione con anticorpi può essere utilizzata più volte (5-7). È sufficiente congelarlo dopo l'uso a -20 o C. Questa procedura funziona almeno per il tampone di ibridazione: 1x PBS (senza Mg++/Ca++), 0,3-1,0% Latte in polvere, Anticorpi.

Durante l'immunocolorazione dopo immunoprecipitazione, il fondo può essere rimosso preconiugando gli anticorpi secondari con quelli primari.

La procedura indicata non è l'unica. Opzioni:

1. Fare tutto con NT su una piattaforma oscillante, ibridazione e confezionamento in sacchetti di plastica (soluzione V ~1,5 ml, a seconda della dimensione del filtro), lavaggio a bagno:
1. ripieno: 3% latte in polvere, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1 ora latte in polvere 0,3%, 1x PBS, antisiero;
3. lavare 3 volte x 5": 1x PBS, 0,05% Tween-20;
4. "II"a/t: 30" in 1x PBS;
5. lavare come al punto 3.

Nonostante il contenuto significativamente inferiore di latte in polvere nel tampone di ibridazione per “I” a/t e la sua completa assenza nel tampone per “II” a/t, questo metodo ha fornito immagini chiare. A quanto pare il successo è stato determinato dalla qualità dei veicoli utilizzati.

2. Il lavaggio e il riempimento vengono effettuati in una vasca. Ibridazione: mettere sul tavolo un pezzo di parafilm (più grande di una membrana) e 0,5-1 ml di soluzione di ibridazione con sopra a/t. Posizionare la membrana con il lato (P) rivolto verso la soluzione, evitando bolle, e coprire la parte superiore con un pezzo di parafilm delle dimensioni della membrana. Incubare 1 ora.

Questo metodo riduce il volume della miscela di ibridazione, ma può deteriorare la qualità dell'ibridazione.

La luminosità massima si verifica 4-5" dopo l'applicazione della soluzione (l'intensità della luminosità ragionevole viene mantenuta per 15-20").

L'analisi Western blot per testare la quantità di calpastatina prevedeva la separazione delle proteine ​​tissutali (30 μg per corsia) mediante elettroforesi in PAGE al 12% in presenza di SDS (Laemmli, 1970) seguita dal trasferimento semi-secco dei polipeptidi su una membrana di nitrocellulosa ( tampone: Tris-HCl 48 mM, glicina 39 mM, 0,0375% SDS, 20% metanolo, pH 9,2). Dopo l'incubazione (2 ore, 20°C) della membrana in tampone TBS (tampone Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5), i siti di legame non specifici sono stati bloccati con una soluzione al 5% di latte scremato in tampone TBST (TBS con l'aggiunta di Tween 20 allo 0,1%, pH 7,5) per 1 ora. Successivamente, la membrana è stata esposta in sequenza agli anticorpi policlonali anti calpastatina (diluizione 1: 2500 in tampone TBST; 1 ora) e agli anticorpi IgG di coniglio coniugati con perossidasi ( diluizione 1: 2000 in tampone TBST; 1 ora).1 h); Ciascuna di queste fasi è stata completata mediante lavaggi ripetuti con tampone TBST. La membrana è stata sottoposta a trattamento standard con il sistema Immune-Star (Bio-Rad, USA).

2.3.6 Altri metodi

Concentrazione proteica le frazioni sono state determinate mediante il metodo Bradford (Bradford, 1976) utilizzando l'albumina sierica bovina (BSA) come standard.

Densitometria le strisce sugli zimogrammi e sulla pellicola radiografica sono state eseguite utilizzando il programma standard "Image J".

Elaborazione dati statistici sono stati condotti utilizzando metodi generalmente accettati di statistica delle variazioni utilizzando i pacchetti software MS Excel e StatGraphics. La significatività delle differenze è stata valutata utilizzando il test U non parametrico (test di Wilcoxon-Mann-Whitney), nonché utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (Korosov, Gorbach, 2007).

Capitolo 3. Risultati della ricerca e discussione

3.1. Sistema calpaina/calpastatina in ratti sottoposti a neurodegenerazione indotta da beta-amiloide durante terapia con estrogeni

La neurodegenerazione è stata indotta nei ratti Wistar di gruppi di età più avanzata: 12 e 24 mesi. L'effetto sperimentale consisteva nella somministrazione intracerebrale di un frammento di 42 membri della proteina precursore dell'amiloide - Abeta(1-42) (un modello sperimentale della malattia di Alzheimer), nonché nella somministrazione intracerebrale combinata del peptide beta-amiloide e nella somministrazione intranasale di un neuroprotettore (estradiolo). Tra gli animali sono stati identificati i seguenti: gruppo di controllo - operato con sham (2 μl di soluzione salina nella zona dell'ippocampo destro); primo gruppo sperimentale - 2 μl di soluzione del peptide Abeta(1-42) (corrispondente a 5 μg di peptide) nell'area dell'ippocampo destro; il secondo gruppo sperimentale - dopo un'iniezione simile del peptide Abeta(1-42), somministrazione intranasale giornaliera di 0,1 mg di 17-beta-estradiolo.

Si è scoperto che in presenza del peptide amiloidogenico nel tessuto nervoso, si verifica l'attivazione del sistema calpaina e il grado di attivazione è correlato positivamente con l'intensità della morte cellulare del tessuto nervoso (densità neuronale). La regolazione delle calpaine può essere effettuata sia a livello di sintesi della proteina enzimatica (o delle sue forme individuali - prodotti di geni diversi), sia a livello post-traduzionale a causa dei processi di autolisi, legandosi all'inibitore endogeno calpastatina o al regolatore allosterico: il calcio.

L'aumento del pool di calpaine autolizzate (118 kDa) rilevato mediante zimografia della caseina nel gruppo di animali n. 2 riflette l'attivazione delle calpaine in vivo. L'attivazione osservata della m-calpaina (120 kDa), apparentemente, come in molte altre situazioni, è associata ad un eccesso di calcio nel citoplasma. Un'altra conferma di questa via di regolazione dell'attività della calpaina è il livello stabile del loro inibitore, la calpastatina, rilevato nel nostro studio.

Come si è scoperto, la terapia con estradiolo inverte l’effetto dell’iperattivazione della calpaina, diminuendo sia l’attività complessiva delle calpaine nel tessuto nervoso sia l’attività delle singole frazioni. In presenza di estradiolo, una percentuale minore del precursore della calpaina va incontro ad autolisi e, di conseguenza, ad attivazione. Sono necessari ulteriori studi sul meccanismo di regolazione dell'attività della calpaina negli animali da esperimento, in particolare sono necessari esperimenti volti a stabilire la fonte dell'eccesso di calcio e trovare mezzi per prevenire queste correnti patologiche.

Il livello di sintesi del proteasoma nel tessuto cerebrale è basso rispetto ad altri organi e tende a diminuire con l'età (se si confrontano gli indicatori in animali di 18, 24 e 30 mesi), come giudicato dalla quantità di alfa-1,2,3 ,5,6 ,7 subunità del proteasoma che formano anelli alfa della particella centrale 20S, universale per proteasomi 20S e 26S.

Sono stati confermati i cambiamenti nel livello di espressione e di attività delle catepsine in diverse aree del cervello negli animali da esperimento. Nel nostro esperimento, la somministrazione intracerebrale del peptide beta-amiloide ha portato ad un aumento significativo (p<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

I nostri dati hanno dimostrato effetti significativi della beta-amiloide e dell’estradiolo sulle prestazioni cognitive nei ratti valutati utilizzando il labirinto acquatico Morris. Nei ratti maschi e femmine precedentemente addestrati, dopo l'iniezione del peptide beta-amiloide nell'ippocampo, è stato osservato un significativo (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

I risultati della microscopia confocale delle sezioni cerebrali hanno mostrato che la somministrazione del peptide beta-amiloide ha portato ad un aumento significativo del livello della sua immunoreattività nei tessuti dell'emisfero destro e sinistro (in misura minore) del cervello. Questi risultati, insieme ai dati comportamentali, dimostrano l'efficacia del farmaco a base di peptide amiloide somministrato e forniscono prove della rappresentatività del modello selezionato di malattia di Alzheimer. La successiva somministrazione di estradiolo ha ridotto la quantità di beta-amiloide nel cervello dei ratti quasi a livelli di controllo. La riduzione dei depositi di amiloide nei ratti trattati con estradiolo indica l'avvio di alcuni processi adattativi nel tessuto nervoso finalizzati al loro utilizzo.

Il meccanismo del ruolo neuroprotettivo dell'estradiolo non è ancora del tutto chiaro, sebbene questo fenomeno sia noto da molto tempo. L'uso dell'estradiolo come neuroprotettore è dettato da diversi motivi. Innanzitutto, l’effetto neuroprotettivo dell’estradiolo è abbastanza noto e descritto in letteratura (McEwen et al., 2001; Asimiadou et al., 2005; Lebesgue et al., 2009). In secondo luogo, è stato dimostrato che l'estradiolo è un neurosteroide nel pieno senso della parola, poiché il cervello contiene tutti gli enzimi necessari per la sua sintesi (Stoffel-Wagner, 2001; Reddy, 2010). In terzo luogo, è noto che l’effetto neuroprotettivo dell’estradiolo è associato ai suoi effetti antiossidanti (Behl et al., 1997) e anti-apoptotici (Asimiadou et al., 2005), cioè con effetti opposti a quelli del peptide Abeta.

I risultati ottenuti potrebbero indicare una risposta adattativa del tessuto nervoso all'introduzione di un peptide tossico. Alcune pubblicazioni indicano che il sistema dell'autofagia lisosomiale potrebbe essere coinvolto nella degradazione del peptide beta-amiloide (Nixon, 2007). È probabile che l'estradiolo stimoli l'autofagia del materiale proteico; Ciò è evidenziato sia dai dati sul contenuto del peptide Abeta nel tessuto cerebrale sia dalla valutazione dell'attività e del livello di espressione delle proteinasi lisosomiali. L'immunoistochimica fluorescente ha rivelato una diminuzione della quantità di beta peptide nei ratti sottoposti a terapia neuroprotettiva con estradiolo.

Sulla base dei dati ottenuti nell'esperimento, si possono trarre le seguenti conclusioni. 1. Il livello di espressione dei geni delle proteinasi lisosomiali CtsD, CtsB, CtsL e delle subunità alfa dei proteasomi e l'attività degli enzimi che codificano nella corteccia cerebrale dei ratti diminuisce con l'invecchiamento. Al contrario, aumenta l'attività delle calpaine negli animali di età più avanzata. 2. Il livello di espressione e attività della catepsina D, nonché l'intensità della proteolisi calcio-dipendente, aumentano significativamente nell'ippocampo e nella corteccia cerebrale dei ratti dopo la somministrazione intracerebrale del peptide beta-amiloide e la funzione cognitiva degli animali ne risente . 3. La somministrazione di estradiolo sullo sfondo dell'intossicazione da beta-amiloide porta ad una diminuzione del contenuto di questo peptide nell'ippocampo dei ratti e ad un miglioramento degli indicatori biochimici e comportamentali negli animali da esperimento. 4. L'attivazione farmacologica della funzione lisosomiale da parte degli estrogeni può promuovere la rimozione dell'Abeta nella malattia di Alzheimer; la normalizzazione dell'omeostasi del calcio in questa situazione previene l'attivazione patologica del sistema della calpaina e, allo stesso tempo, la perdita di neuroni lungo le vie di morte cellulare dipendenti dalla calpaina.

Nella pratica della diagnostica di laboratorio delle malattie infettive, a volte è necessario determinare gli anticorpi non contro un agente patogeno in generale, ma contro alcune delle sue proteine ​​(antigeni), cioè uno spettro di anticorpi specifici. Se a questo scopo viene utilizzato il metodo del test immunoassorbente legato a un enzima, in questo caso è necessario prima isolare e purificare gli antigeni necessari dalla coltura del patogeno. Le proteine ​​risultanti vengono applicate separatamente alla fase solida. Se si utilizza una piastra a 96 pozzetti, in ciascun pozzetto viene inserito un tipo di antigene. Quindi gli anticorpi specifici vengono determinati con un metodo indiretto.

Dalla presenza di una reazione positiva in un pozzetto con un particolare antigene, si può giudicare la presenza dei corrispondenti anticorpi specifici. Questi tipi di sistemi di test immunoenzimatici sono offerti dalle aziende produttrici, ma il metodo di immunoblotting (Western blot) si è diffuso grazie al suo maggior contenuto informativo e alla facilità di esecuzione dello studio stesso.

L'immunoblotting consente di determinare simultaneamente e allo stesso tempo in modo differenziato gli anticorpi nel siero sanguigno verso tutte le proteine ​​​​diagnosticamente significative dell'agente patogeno. La traduzione dall'inglese Western blot significa trasferimento occidentale (letteralmente - blotting). La storia di questo termine insolito è la seguente.

Nel 1975, uno scienziato di nome E. Southern propose per primo un metodo per trasferire frammenti di DNA separati elettroforeticamente da un gel a una membrana. Secondo l’autore il metodo si chiamava Southern blot, che tradotto significa “trasferimento del sud”. Il metodo di trasferimento delle molecole di RNA, a sua volta, è stato soprannominato dagli esperti Northern blot - "trasferimento settentrionale". Dapprima per scherzo, poi questo nome si è affermato nella letteratura scientifica ufficiale.

Nel 1979 G. Towbin pubblicò i risultati dei primi esperimenti sul blotting delle proteine. In continuità con la tradizione dei nomi “geografici” per i metodi di trasferimento delle macromolecole biologiche, questo metodo cominciò a essere chiamato trasferimento “occidentale” - Western blot.

La prima fase di questo metodo prevede la separazione elettroforetica di una miscela di proteine ​​patogene in un gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS). L'SDS, essendo un tensioattivo, avvolge uniformemente le molecole proteiche e conferisce loro una carica negativa di circa la stessa grandezza. Pertanto, le molecole si muovono in un campo elettrico in una direzione e la velocità di movimento dipende solo dalla dimensione della molecola (peso molecolare) della proteina.

Come risultato della procedura elettroforetica, si ottiene una piastra di gel, nello spessore della quale le proteine ​​si trovano sotto forma di zone lineari sottili separate. Secondo la direzione del movimento, sono divise nel seguente ordine: le proteine ​​con un grande peso molecolare, circa 120-150 kDa, sono più vicine all'inizio, e le proteine ​​con una massa di 5-10 kDa si sono spostate più lontano verso il traguardo linea. Nella seconda fase, la piastra di gel viene posizionata su un foglio di nitrocellulosa e questa struttura viene posta tra gli elettrodi di una sorgente di corrente continua. Sotto l'influenza di un campo elettrico, le proteine ​​fluiscono dal gel poroso verso una membrana più densa, dove vengono fissate saldamente.

La macchia risultante viene trattata con una soluzione bloccante contenente proteine ​​antigenicamente indifferenti e/o detergenti non ionici (Tween 20), che bloccano i siti privi di antigene sulla membrana. Il foglio di membrana viene quindi tagliato in strisce strette in modo che ciascuna striscia contenga tutte le frazioni antigeniche. I passaggi descritti vengono eseguiti dal produttore.

I sistemi di test commerciali per la determinazione degli anticorpi mediante immunoblotting contengono macchie (strisce o strisce) pronte per il test. L'utente determina l'intero spettro di anticorpi specifici contro le proteine ​​patogene utilizzando il metodo indiretto. Una sostanza incolore solubile viene utilizzata come cromogeno per effettuare una reazione cromatica (enzimatica), il cui prodotto acquisisce colore, diventa insolubile e si deposita (precipita) sulla nitrocellulosa.

Come risultato di reazioni immunitarie ed enzimatiche sequenziali, in presenza di anticorpi contro le proteine ​​​​patogene nel campione di prova, sulla macchia compaiono strisce trasversali scure, la cui posizione si trova nella zona di alcune proteine ​​​​patogene. Ciascuna di queste bande indica la presenza di anticorpi specifici contro l'antigene corrispondente. Il risultato di uno studio effettuato mediante immunoblotting viene fornito sotto forma di un elenco di anticorpi contro proteine ​​specifiche dell'agente patogeno. Ad esempio: “sono stati rilevati anticorpi contro le proteine ​​p17 e p24”.

Le macchie di nitrocellulosa possono essere conservate essiccate per lungo tempo dopo lo sviluppo. Tuttavia, l'intensità del colore si indebolisce notevolmente. Le macchie bagnate possono essere fotografate o le loro immagini grafiche possono essere inserite nella memoria dei personal computer mediante scanner. Speciali programmi per computer consentono di elaborare i risultati e monitorare rapidamente la dinamica dello spettro degli anticorpi durante l'osservazione dinamica

Il Western blotting è un metodo che ricerca anticorpi specifici contro i batteri che causano la malattia di Lyme. Cos’è un test Western Blot? Come interpretare i risultati dello studio?

Blotting occidentaleè un test che ricerca gli anticorpi prodotti dall'organismo contro i batteri che causano la malattia di Lyme. Sulla superficie dei batteri ci sono antigeni contro i quali il corpo possiede anticorpi specifici delle classi IgM e IgG. IgM.

Immunoglobulina M (IgM) - prodotta quando il nostro corpo incontra per la prima volta un determinato agente patogeno. Un aumento della quantità di IgM contro un dato agente patogeno indica l'inizio del processo patologico.

L'immunoglobulina G (IgG) viene prodotta dall'organismo dopo le IgM, il livello più alto viene raggiunto circa sei mesi dopo l'infezione e, a differenza delle IgM, gli anticorpi possono rimanere nel sangue per un tempo molto lungo, anche diversi anni.

Test Western Blot - indicazioni per l'esecuzione

Il Western Blot viene utilizzato nella seconda fase della diagnosi della borreliosi, quando il test ELISA (primo test) fornisce un risultato positivo o equivoco. Tuttavia, non viene utilizzato quando il test ELISA è chiaramente negativo.

Western blotting: cos'è il test?

Il test Western Blot per la borreliosi (malattia di Lyme) valuta accuratamente gli anticorpi contro vari frammenti di batteri. Diversi anticorpi
contro i singoli frammenti batterici vengono riflessi graficamente come strisce nere su carta di nitrocellulosa.

1. Per eseguire il test sono necessari due elementi principali: il siero del sangue del paziente e i batteri della borreliosi uccisi e frammentati in coltura.

Non eseguire questo test subito dopo un morso di zecca. Aspetta almeno 4 settimane. Il costo di uno studio Western Blotting in entrambe le classi di anticorpi è di circa 2500-5000 rubli.

2. Sotto l'influenza della corrente elettrica, la distribuzione avviene in fattori, principalmente batteri ottenuti da una coltura cellulare, comprese le proteine ​​​​batteriche (antigeni). Queste proteine ​​vengono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa. La membrana viene tagliata a strisce.

3. La striscia antigenica, in combinazione con il siero sanguigno del paziente, viene colorata utilizzando una tecnica speciale che rileva gli anticorpi specificamente associati agli antigeni Sprechete Borrelia.

4. Nelle aree in cui gli anticorpi del paziente sono legati alle proteine ​​(antigeni) dei batteri della borreliosi, notiamo strisce caratteristiche (che indicano l'infezione da batteri di Lyme). Il risultato del test è positivo.

Ciascuna banda corrisponde a una proteina batterica (antigene). Se le proteine ​​e gli anticorpi delle cellule della borreliosi non si combinano, la banda non apparirà. Allora il risultato è negativo.

Test Western Blot: quando farlo?

La diagnosi precoce della malattia di Lyme è problematica a causa della cosiddetta finestra sierologica. Questo è il periodo che va dall'inizio dell'infezione all'inizio della produzione di anticorpi rilevabili da parte dell'organismo. Per la malattia di Lyme, la finestra sierologica dura in media 4 settimane.

L'esecuzione dei test meno di 4 settimane dopo la puntura di zecca comporta il rischio di ottenere un risultato falso negativo.

Test Western Blot: risultato positivo

Avere anticorpi contro la Borrelia significa avere la malattia di Lyme. Tuttavia è difficile rispondere alla domanda se l’infezione sia attiva o meno.

Gli anticorpi IgG derivanti dall'infezione possono essere rilevati nel sangue anche 10 e talvolta 20 anni dopo la diagnosi della malattia di Lyme.

Accade anche che gli anticorpi IgM rilevati (normalmente considerati un marcatore attivo di infezione) possano essere persistenti e non indicare un'infezione attiva.

Test Western Blot: risultato negativo

Il test può dare un risultato negativo nel periodo iniziale della malattia, ad es. Nelle prime settimane dopo il morso.

Il test Western blot può essere eseguito non solo se si sospetta la malattia di Lyme, ma anche in caso di infezione da H. pylori (che causa ulcere peptiche) o HIV.

Il test Western blot può anche dare un risultato falso negativo in un'altra situazione - quando in una vecchia borreliosi cronica la produzione di anticorpi è stata interrotta o quando gli anticorpi sono stati completamente esauriti nella lotta contro questa malattia.

Se il sospetto della malattia di Lyme è forte, il test Western Blot dovrebbe essere ripetuto più volte, ad esempio ogni poche settimane, per arrivare al punto in cui sono presenti anticorpi nel sangue.

La presenza di anticorpi nella malattia di Lyme attiva varia e una persona che risulta negativa al test ha la possibilità di risultare positiva se sottoposta nuovamente al test poche settimane dopo. A volte la diagnosi viene confermata solo dopo la quarta o quinta volta.

In questo caso alcuni medici cercano di ottenere la conferma dell'infezione in modo diverso: trattano il paziente con antibiotici per diverse settimane e dopo 5-6 settimane lo inviano al Western blotting.

Il trattamento con antibiotici per questo periodo di tempo non curerà la malattia cronica, ma altererà il sistema immunitario abbastanza da garantire la presenza di abbastanza anticorpi nel sangue da poter essere rilevati. Il risultato di un test Western blot deve essere interpretato da un medico specializzato nel trattamento della malattia di Lyme

Il test WB può essere eseguito anche durante la terapia antibatterica, ma con gli antibiotici la probabilità di un risultato positivo è leggermente inferiore. Il modo più semplice per diagnosticare la malattia con questo test è 6 settimane dopo l'interruzione della terapia antibiotica.

Importante

L'interpretazione dello studio è l'interpretazione delle bande. Come regola generale, si dovrebbe presumere che maggiore è il numero di bande, più affidabile è la diagnosi. Tre strisce sono davvero una grande certezza e 5-6 strisce indicano la malattia di Lyme con una probabilità quasi del 100%.

Le bande IgM hanno un valore diagnostico maggiore perché suggeriscono una fase attiva di borreliosi trasmessa dalle zecche, sebbene gli anticorpi rilevati nella classe IgM (bande IgM) possano essere persistenti e non indicare un'infezione attiva. Risulta che le IgM sono elevate all'inizio dell'infezione e, contrariamente alla logica, nella malattia cronica di Lyme.

Livelli elevati di anticorpi IgG possono essere considerati un'infezione residua o possono indicare una malattia cronica attiva.

Anche un risultato negativo del test non significa che la malattia di Lyme non sia presente. Un risultato negativo del test significa solo che nel sangue non sono presenti anticorpi contro i batteri della borreliosi - ciò può verificarsi, ad esempio, quando i batteri sono entrati nell'organismo e la produzione di anticorpi non è ancora iniziata (i medici chiamano questo periodo finestra sierologica).

A causa della varietà dei metodi utilizzati per condurre questo studio, è difficile formulare raccomandazioni universali riguardo all’interpretazione. Ogni laboratorio utilizza i propri criteri.

La malattia può essere rilevata solo da un medico specialista sulla base dei sintomi e dei risultati dei test di laboratorio. Il test Wester Blot non può essere interpretato senza tenere conto dei sintomi.