Sadržaj

GPM.1.7.2.0022.15 Određivanje autentičnosti i čistoće imunobioloških lijekova primjenom Western blot metode

OPĆI FARMAKOPEJSKI ČLANAK

Predstavljen po prvi put

Ova opća farmakopejska monografija odnosi se na Western blot metodu, jednu od varijanti imunoblottinga, koja se koristi za procjenu autentičnosti i čistoće imunobioloških lijekova (IMP) na bazi visoko pročišćenih proteina, uključujući one dobivene tehnologijom rekombinantne DNA.

U prvoj fazi provodi se elektroforeza u poliakrilamidnom gelu s natrijevim dodecil sulfatom (tzv. SDS-PAGE elektroforeza) za razdvajanje proteina. Proteini se zatim prenose na nitroceluloznu membranu ili PVDF membranu. Detekcija se provodi pomoću antitijela specifičnih za protein koji se detektira, konjugiranih s alkalnom fosfatazom ili peroksidazom hrena (izravna verzija ELISA-e), ili sekvencijalno koristeći prva antitijela na protein koji se detektira, a druga antitijela (tzv. antiglobulinski serum ), prva antitijela specifična za imunoglobulin, konjugirana s alkalnom fosfatazom ili peroksidazom hrena (indirektna verzija ELISA).

Ovaj OFS opisuje metodu detekcije koja se temelji na reakciji boje, kao jednu od trenutno najraširenijih. Za detekciju se također mogu koristiti kemiluminiscentne metode, uključujući pojačanu kemiluminiscenciju, te metode radioaktivnih ili fluorescentnih oznaka (RIA ili RIF).

Ispitivanje se provodi s farmaceutskim supstancama ili gotovim proizvodima.

Prilikom procjene autentičnosti, u fazi elektroforeze, osim testiranih uzoraka, u jažice gela treba dodati sljedeće otopine: uzorak negativne kontrole (1-struki pufer za pripremu uzorka), mješavinu markera molekularne težine (upotreba preporučuju se prethodno obojeni markeri molekularne težine), standardni uzorak proteina koji se ispituje (ako je dostupan), ovjeren na propisani način. Pri ocjeni čistoće (nečistoće) potrebno je dodatno predvidjeti dodavanje uzorka s koncentracijom proteina koja odgovara granici detekcije ili kvantifikacije nečistoće (ovisno o namjeni metode) i utvrditi na temelju rezultata metode validacija. Kod procjene čistoće potrebno je usporediti rezultate blota s rezultatima elektroforeze u poliakrilamidnom gelu; tehnika bi trebala otkriti 1% nečistoće.

Metodologija

Da bi se proteini razdvojili prema njihovoj molekularnoj težini, najprije se provodi elektroforeza u skladu s postupkom navedenim u Općoj farmakopejskoj monografiji “Elektroforeza u poliakrilamidnim gelovima”.

Za prijenos proteina koristi se uređaj za prijenos proteina. Svi radovi se izvode u gumenim rukavicama. Volumen svih upotrijebljenih otopina mora biti dovoljan da potpuno uroni membranu na koju se prenose proteini.

Nakon elektroforeze za pripremu gela za imunobloting, on se napuni otopinom pufera za prijenos proteina (osim ako nije drugačije naznačeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji), stavi se na orbitalnu tresilicu i drži 10-15 minuta. Zatim se pripremi sloj nitrocelulozne ili PVDF membrane koji odgovara veličini gela. Kada se koristi nitrocelulozna membrana, list se drži 5 minuta u deioniziranoj vodi, a zatim 5 minuta u puferskoj otopini za prijenos proteina (osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji). Kada koristite PVDF membranu, potrebno ju je držati u otopini metanola ili alkohola 10-15 minuta, a zatim izvršiti iste korake kao i za nitroceluloznu membranu.

Za prijenos proteina na nitroceluloznu ili PVDF membranu, sastavlja se "sendvič". Da biste to učinili, posebna spužva koja je uključena u uređaj za prijenos proteina navlaži se otopinom pufera za prijenos proteina i stavi na poseban plastični okvir, na koji se stavlja jedan do tri lista filter papira (na primjer, Whatman 3MM), prethodno izrezanog kako bi odgovarao veličina membrane i proteini natopljeni otopinom za prijenos. Na vrh se stavlja gel na čiju se površinu pažljivo postavlja pripremljena ploča nitrocelulozne ili PVDF membrane (bez mjehurića zraka). Od jednog do tri lista filtar papira, prethodno navlaženog u otopini za prijenos proteina, stavljaju se na membranu, a na vrhu se prekriju drugom posebnom spužvom namočenom u otopinu za prijenos proteina. Okvir se učvrsti stezaljkama i polako uroni u uređaj za elektroforezu napunjen otopinom za prijenos proteina, membranski list okrenut prema anodi. Uključite uređaj. Elektroforetski prijenos proteina provodi se na sobnoj temperaturi tijekom 25 minuta, postavljajući ograničenje struje na brzinu od A max = 2 mA/cm 2 (na primjer, za gel dimenzija 10 × 10 cm 2 A max = 200 mA), osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskom članku ili regulatornoj dokumentaciji.

Dopušteno je koristiti opremu za polusuhi prijenos proteina iz gela u membranu u skladu s uputama za njezinu uporabu.

Po završetku prijenosa, "sendvič" se rastavlja. Membrana se ispere fosfatno puferiranom fiziološkom otopinom (PBS).

Potpunost prijenosa proteina procjenjuje se vizualno prijenosom obojenih markera molekularne težine, od kojih bi sve glavne proteinske trake trebale biti otkrivene na membrani.

Otkrivanje

Da bi se otkrili rezultati Western blot metode, ispitivani lijek se tretira (hibridizira) antitijelima. Da bi se to postiglo, membrana s proteinima koji su na nju preneseni stavlja se u spremnik s otopinom pufera za blokiranje i inkubira na orbitalnoj tresilici 30-60 minuta (osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji) kako bi se spriječila nespecifična sorpcija antitijela na membrani.

Nakon toga isperite membranu u otopini pufera za pranje tri puta po 5 minuta, osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji.

Potom se membrana tretira otopinom prvih protutijela na analizirani protein, pripremljenom pomoću puferske otopine za protutijela (osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji) neposredno prije uporabe u skladu s uputama za uporabu. Tretman protutijelima provodi se na sobnoj temperaturi 30-60 minuta (osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji).

Zatim se membrana ispire tri puta po 5 minuta puferskom otopinom kako bi se uklonila nevezana protutijela na orbitalnoj mućkalici na sobnoj temperaturi, osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji.

Nakon pranja membrane provodi se tretman (hibridizacija) otopinom sekundarnih antitijela. Kao druga protutijela koriste se poliklonska protutijela na imunoglobuline životinjske vrste koja su korištena za dobivanje prvih protutijela. Ta su protutijela konjugirana s enzimom (peroksidaza hrena ili alkalna fosfataza). Da biste izvršili ovaj korak, ponovite gore opisani postupak, zamjenjujući prvu otopinu antitijela drugom otopinom antitijela. Zatim se membrana ispere od nevezanih drugih protutijela na način sličan prvom.

Razvijanje imunoblot uzorka na membrani provodi se otopinom tetrametilbenzidin supstrata (TMB) za antitijela konjugirana na peroksidazu hrena ili otopinom za razvoj alkalne fosfataze - kada se koriste antitijela konjugirana na alkalnu fosfatazu (osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejska monografija ili regulatorna dokumentacija).

Reakcija se zaustavlja ispiranjem mrlje deioniziranom vodom. Višak vode se uklanja s površine membrane filter papirom i suši na zraku na tamnom mjestu.

Evaluacija rezultata

Pri procjeni autentičnosti, glavne obojene trake na razvijenoj membrani trebaju odgovarati glavnim obojenim prugama na elektroferogramu.

Količina analizirane tvari i sadržaj nečistoća te njihov omjer određuju se denzitometrijski.

Kriteriji prikladnosti sustava

Rezultati Western blot metode mogu se uzeti u obzir ako:

• markeri molekularne težine ravnomjerno su raspoređeni duž cijele duljine odgovarajuće staze gela;
• mrlja pokazuje sve glavne trake identificirane kada je gel obojen Coomassie jarko plavim R-250 ili G-250;
• identificira se uzorak s minimalnom koncentracijom utvrđenom u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji

Kriteriji prihvaćanja rezultata

• Usklađivanje mrlje ispitnog uzorka s mrljom referentnog uzorka, na primjer, odgovarajućeg standardnog uzorka temeljenog na pročišćenom proteinu (supstanci);
• usklađenost molekularne težine glavne identificirane komponente sa zahtjevima specifikacije;
• usklađenost sadržaja detektirane nečistoće u standardnom uzorku s rasponom utvrđenim u potvrdi za standardni uzorak.

Western blot testiranje identiteta i čistoće treba se koristiti s dokazanim karakteristikama validacije za specifičnost i granicu detekcije nečistoće.

Značajke validacije metode

Pri korištenju metodologije za ocjenu autentičnosti potrebno je obrazložiti kriterije prihvatljivosti rezultata; Preporučljivo je koristiti standardni uzorak na bazi pročišćenih proteina, certificiran na propisan način.

Kada se koristi metoda za ocjenu čistoće, potrebno je opravdati granicu detekcije nečistoće. Pri kvantitativnom određivanju potrebno je obrazložiti granicu kvantitativnog određivanja nečistoće, navesti linearni raspon pri određivanju glavne komponente i nečistoća, preciznost i ispravnost metode. U tu svrhu preporučljivo je koristiti standardni uzorak na bazi pročišćenog proteina. Prilikom izmjena metode navedene u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji moraju se potvrditi validacijske karakteristike prethodno odobrene metode. Sljedeće promjene podliježu potvrđivanju:

• korištenje različitog broja uzoraka nanesenih na gel;
• mijenjanje uvjeta za prijenos proteina iz gela u membranu, uključujući promjenu korištene opreme;
• promjene u sastavu puferskih otopina;
• mijenjanje metode detekcije ispitivane tvari.

Bilješke

1. Puferska otopina za prijenos proteina pH 8,3. Ako nema drugih uputa u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji, upotrijebite jednu od dolje opisanih metoda za pripremu otopina (vidi Opciju 1 i Opciju 2). Otopina za prijenos može se koristiti 2-3 puta. Otopina se čuva 6 mjeseci na temperaturi od 4 do 8 0 C.

Opcija 1. U graduiranu čašu zapremine 3000 ml stavi se 7,86 g tris(hidroksimetil)aminometana, 33,75 g glicina, doda se do 2400,0 ml deionizirane vode i miješa na magnetskoj miješalici do potpunog otapanja. Mjeri se pH, koji bi trebao biti jednak 8,3 - 8,4 (nije dopušteno podešavati pH otopine kiselinom ili lužinom). Dodajte 600,0 ml alkohola i promiješajte.

opcija 2. 5,8 g tris(hidroksimetil)aminometana, 2,9 g glicina, 11,55 ml 10% otopine natrijevog dodecil sulfata stavi se u graduiranu čašu zapremine 1000 ml, doda se 800,0 ml deionizirane vode i miješa na magnetskoj miješalici do potpunog otapanja, mjeri se pH (8,3-8,4). Dodati 200,0 ml 100% metanola i promiješati. Ako se koristi PVDF membrana, tada se natrijev dodecil sulfat isključuje iz puferske otopine, a količina alkohola se smanjuje na 100,0 ml, čime se povećava volumen dodane vode na 900,0 ml.

1. Fosfatno puferirana fiziološka otopina (PBS), pH 7,2(osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji). 4500,0 ml deionizirane vode ulije se u graduirani spremnik i redom doda: 40,0 g natrijevog klorida, 1,0 g kalijevog klorida, 5,75 g natrijevog fosfata disupstituiranog 2-vodenog, 1,0 g kalijevog fosfata disupstituiranog (svaka sljedeća sol dodaje se nakon potpuno rastakanje prethodnog). Namjestite pH na 7,2 otopinom 70% fosforne kiseline ili otopinom 45% natrijevog hidroksida. Podesite volumen na 5000,0 ml deioniziranom vodom. Otopina se filtrira i čuva 3 mjeseca na temperaturi od 4 - 8 0 C.
2. Pufer otopina za pranje. Dodajte 5,0 ml 10% otopine Tween-20 u odmjernu tikvicu od 1000 ml, prilagodite volumen otopine do oznake pomoću PBS-a i promiješajte. Otopina se čuva 1 mjesec na temperaturi od 4 °C do 8 °C.
3. Otopina pufera za blokiranje. U 100,0 ml puferske otopine za ispiranje dodajte 5,0 mg goveđeg serumskog albumina (ili drugog proteina), osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji, i miješajte dok se potpuno ne otopi. Otopina se priprema prije upotrebe.
4. Puferska otopina protutijela. U 100,0 ml puferske otopine za ispiranje dodajte 2,0 mg goveđeg serumskog albumina (ili drugih proteina), osim ako nije drugačije navedeno u farmakopejskoj monografiji ili regulatornoj dokumentaciji, i miješajte dok se potpuno ne otopi. Otopina se priprema prije upotrebe.

1. TMB rješenje— otopina za razvoj peroksidaze hrena. Koristiti TMB supstrat, spreman za upotrebu.
2. Otopina za razvijanje alkalne fosfataze. Otopite 1 tabletu BCIP/NBT supstrata u 10,0 ml deionizirane vode. Otopina se priprema neposredno prije upotrebe.

Su česti.

Sve zapadnjačke inscenacijske metode sastoje se od sljedećih koraka:

1) prijenos proteina iz gela u membranu;
2) blokiranje nespecifične sorpcije;
3) adsorpcija I-antitijela;
4) pranje;
5) adsorpcija II-antitijela;
6) pranje;
7) razvoj filtera;

Koju vrstu membrane koristiti: NC ili PVDV (kažu da je ova druga osjetljivija) ovisi samo o vašem ukusu. NC membrana je krhkija, ali uz pažljiv rad to se ne primjećuje.

Bodovi.

Hoćete li podrezati gel, ostavljajući samo područje koje želite vidjeti na slici prije prijenosa, nakon prijenosa ili ga uopće ne podrezivati, ovisi o vašoj želji da sačuvate membranu i antitijela.

Može se raditi u gel kupki.

Ali bolje je nanijeti sve odjednom bez mjehurića.

Ili ~3mA po pojedinačnoj traci.

Ponekad je korisno označiti položaj granica gela, jažica itd.

Možete kontrolirati koliko proteina ostaje u gelu nakon prijenosa bojenjem gela.

Hibridizacija.

Filter treba uvijek biti mokar.

Osušena PVDF membrana mora se navlažiti metanolom.

Strana P (na koju je izvršen prijenos) treba biti u kontaktu s otopinom.

Hibridizacija s a/t provodi se u hibridizatoru na 26 o C u malim cilindrima ili CF epruvetama od 50 ml. Volumen hibridizacijske otopine je ~3ml (što je moguće manje, ali tako da se membrana ne osuši).

Pranje i punjenje: s NT, mućkanje u kadi (poklopac od tipova) V = 30-50ml.

Ili bacite otopinu ili provedite hibridizaciju u njoj, samo nemojte kapati koncentriranu t/t na filtar.

Za punjenje nespecifičnih materijala najbolje je koristiti mlijeko u prahu (može i BSA, ali nama se manje sviđa). Različite serije malo se razlikuju u intenzitetu pozadine.

Ulijte otopinu za hibridizaciju u CF epruvetu od 50 ml, dodajte potrebnu količinu a/t, promiješajte. Položite filtar uz stijenku epruvete i stavite ga u hibridizator.

Ako ne znate u kojem razrjeđenju a/ts rade, morat ćete to odrediti eksperimentalno.

Vrijeme interakcije s protutijelima može se povećati ili smanjiti ovisno o vašim protutijelima.

Hibridizacija se provodi u 0,1-0,15 M NaCl, smanjenje ionske jakosti uzrokuje jaku nespecifičnu hibridizaciju.

Jako važno!!! Otopina s protutijelima može se koristiti više puta (5-7). Dovoljno ga je nakon upotrebe zamrznuti na -20 o C. Ovaj postupak djeluje barem za hibridizacijski pufer: 1x PBS (bez Mg++/Ca++), 0,3-1,0% suho mlijeko, antitijela.

Kod imunološkog bojenja nakon imunoprecipitacije, pozadina se može ukloniti prethodnom konjugacijom sekundarnih antitijela na primarna.

Navedeni postupak nije jedini. Mogućnosti:

1. Sve raditi s NT na ljuljačkoj platformi, hibridizacija i pakiranje u plastične vrećice (V otopina ~1,5ml, ovisno o veličini filtera), pranje u kadi:
1. punjenje: 3% mlijeko u prahu, 1x PBS, 30-40";
2. "I"a/t: 1h 0,3% mlijeko u prahu, 1x PBS, antiserum;
3. isprati 3 puta x 5": 1x PBS, 0,05% Tween-20;
4. "II"a/t: 30" u 1x PBS;
5. pranje kao u koraku 3.

Unatoč značajno nižem sadržaju suhog mlijeka u hibridizacijskom puferu za “I” a/t i njegovom potpunom odsustvu u puferu za “II” a/t, ova metoda je dala jasne slike. Očito je uspjeh odredila kvaliteta korištenih vozila.

2. Pranje i punjenje se obavljaju u kadi. Hibridizacija: na stol staviti komadić parafilma (veći od membrane) i na njega 0,5-1 ml hibridizacijske otopine s a/t. Postavite membranu sa stranom (P) okrenutom prema otopini, izbjegavajući mjehuriće, i prekrijte vrh komadom parafilma veličine membrane. Inkubirati 1 h.

Ova metoda smanjuje volumen hibridizacijske smjese, ali može pogoršati kvalitetu hibridizacije.

Maksimalni sjaj javlja se 4-5" nakon nanošenja otopine (razuman intenzitet sjaja održava se 15-20").

Western blot analiza za testiranje količine kalpastatina uključivala je odvajanje tkivnih proteina (30 μg po traci) elektroforezom u 12% PAGE u prisutnosti SDS (Laemmli, 1970.) nakon čega je slijedio polusuhi prijenos polipeptida na nitroceluloznu membranu ( pufer: 48 mM Tris-HCl, 39 mM glicin, 0,0375% SDS, 20% metanol, pH 9,2). Nakon inkubacije (2 h, 20°C) membrane u TBS puferu (50 mM Tris-HCl pufer, 150 mM NaCl, pH 7,5), nespecifična vezna mjesta su blokirana 5% otopinom obranog mlijeka u TBST puferu (TBS uz dodatak 0,1% Tween 20, pH 7,5) tijekom 1 sata. Zatim je membrana sekvencijalno izložena poliklonskim protutijelima na kalpastatin (razrjeđenje 1:2500 u TBST puferu; 1 sat) i protutijelima na zečji IgG konjugiranim s peroksidazom ( razrjeđenje 1:2000 u TBST puferu; 1 sat).1 h); Svaki od ovih koraka je završen ponovljenim ispiranjem s TBST puferom. Membrana je podvrgnuta standardnom tretmanu sa sustavom Immune-Star (Bio-Rad, SAD).

2.3.6 Ostale metode

Koncentracija proteina frakcije su određene Bradfordovom metodom (Bradford, 1976.) koristeći goveđi serumski albumin (BSA) kao standard.

Denzitometrija pruge na zimogramima i rendgenskom filmu izvedene su standardnim programom "Image J".

Statistička obrada podataka provedeni su općeprihvaćenim metodama varijacijske statistike korištenjem programskih paketa MS Excel i StatGraphics. Značajnost razlika procijenjena je neparametrijskim U testom (Wilcoxon-Mann-Whitneyjev test), kao i jednosmjernom analizom varijance (Korosov, Gorbach, 2007).

Poglavlje 3. Rezultati istraživanja i rasprava

3.1. Sustav kalpain/kalpastatin u štakora podvrgnutih neurodegeneraciji izazvanoj beta-amiloidom tijekom terapije estrogenom

Neurodegeneracija je inducirana kod Wistar štakora starijih dobnih skupina - 12 i 24 mjeseca. Eksperimentalni učinak sastojao se od intracerebralne primjene 42-članog fragmenta proteina prekursora amiloida - Abeta(1-42) (eksperimentalni model Alzheimerove bolesti), kao i kombinirane intracerebralne primjene beta-amiloidnog peptida i intranazalne primjene neuroprotektor (estradiol). Među životinjama identificirane su: kontrolna skupina - lažno operirana (2 μl fiziološke otopine u području desnog hipokampusa); prva pokusna skupina - 2 μl otopine Abeta(1-42) peptida (što odgovara 5 μg peptida) u područje desnog hipokampusa; druga pokusna skupina - nakon slične injekcije Abeta(1-42) peptida, dnevno intranazalno davanje 0,1 mg 17-beta-estradiola.

Utvrđeno je da u prisutnosti amiloidogenog peptida u živčanom tkivu dolazi do aktivacije kalpainskog sustava, a stupanj aktivacije pozitivno korelira s intenzitetom stanične smrti živčanog tkiva (gustoća neurona). Regulacija kalpaina može se provoditi kako na razini sinteze enzimskog proteina (ili njegovih pojedinačnih oblika – produkata različitih gena), tako i na posttranslacijskoj razini zahvaljujući procesima autolize, vezanja na endogeni inhibitor kalpastatin ili na alosterički regulator – kalcij.

Porast u pulu autoliziranih kalpaina (118 kDa) detektiran kazeinskom zimografijom u skupini životinja br. 2 odražava aktivaciju kalpaina in vivo. Uočena aktivacija m-kalpaina (120 kDa), očito je, kao i u mnogim drugim situacijama, povezana s viškom kalcija u citoplazmi. Još jedna potvrda ovakvog puta regulacije aktivnosti kalpaina je stabilna razina njihovog inhibitora, kalpastatina, detektirana u našem istraživanju.

Kako se pokazalo, terapija estradiolom poništava učinak hiperaktivacije kalpaina, pri čemu se smanjuje i ukupna aktivnost kalpaina u živčanom tkivu i aktivnost pojedinih frakcija. U prisutnosti estradiola, manji dio prekursora kalpaina podliježe autolizi i, posljedično, aktivaciji. Potrebna su daljnja istraživanja mehanizma regulacije aktivnosti kalpaina u pokusnih životinja, a posebno su potrebni pokusi usmjereni na utvrđivanje izvora viška kalcija i pronalaženje načina za sprječavanje ovih patoloških tokova.

Razina sinteze proteasoma u moždanom tkivu niska je u usporedbi s drugim organima i ima tendenciju pada s godinama (uspoređujući pokazatelje kod životinja starih 18, 24 i 30 mjeseci), što se procjenjuje prema količini alfa-1,2,3. ,5,6 ,7 proteasomske podjedinice koje tvore alfa prstenove jezgre 20S čestice, univerzalne za 20S i 26S proteasome.

Potvrđene su promjene u razini ekspresije i aktivnosti katepsina u različitim područjima mozga kod pokusnih životinja. U našem eksperimentu, intracerebralna primjena beta-amiloidnog peptida dovela je do značajnog povećanja (str<0,05) экспрессии гена катепсина D в коре (правом полушарии) головного мозга крыс по сравнению с животными контрольной группы. В неокортексе крыс, которые после введения бета-амилоидного пептида получали эстрадиол, относительный уровень экспрессии данного гена не отличался от контрольных значений, то есть восстанавливался до нормального уровня. В области правого гиппокампа введение бета-амилоидного пептида привело к увеличению экспрессии гена катепсина D приблизительно в 7 раз (p<0,001). Последующее введение эстрадиола привело к еще большему возрастанию (в 30 раз) относительной экспрессии указанного гена (p<0,001).

Naši podaci pokazali su značajne učinke beta-amiloida i estradiola na kognitivnu izvedbu štakora procijenjenu pomoću Morrisovog vodenog labirinta. U prethodno treniranih ženki i mužjaka štakora, nakon injekcije beta-amiloidnog peptida u hipokampus, došlo je do značajnog (p<0,05) увеличилось время поиска скрытой подводной платформы. Последующее введение эстрадиола сокращало время поиска подводной платформы у животных обоих полов по сравнению с таковыми, получившими только бета-амилоид. При этом у самок время поиска уменьшилось более значимо (p<0,01), чем у самцов (p<0,05).

Rezultati konfokalne mikroskopije presjeka mozga pokazali su da je primjena beta-amiloidnog peptida dovela do značajnog povećanja razine njegove imunoreaktivnosti u tkivima i desne i lijeve (u manjoj mjeri) hemisfere mozga. Ovi rezultati, zajedno s podacima o ponašanju, pokazuju učinkovitost primijenjenog lijeka amiloidnog peptida i pružaju dokaze o reprezentativnosti odabranog modela Alzheimerove bolesti. Naknadna primjena estradiola smanjila je količinu beta-amiloida u mozgu štakora na gotovo kontrolnu razinu. Smanjenje amiloidnih naslaga u štakora liječenih estradiolom ukazuje na pokretanje određenih adaptivnih procesa u živčanom tkivu usmjerenih na njihovo iskorištavanje.

Mehanizam neuroprotektivne uloge estradiola još nije u potpunosti razjašnjen, iako je ovaj fenomen već dugo uočen. Korištenje estradiola kao neuroprotektora diktira nekoliko razloga. Prvo, neuroprotektivni učinak estradiola prilično je dobro poznat i opisan u literaturi (McEwen i sur., 2001.; Asimiadou i sur., 2005.; Lebesgue i sur., 2009.). Drugo, pokazalo se da je estradiol neurosteroid u punom smislu te riječi budući da mozak sadrži sve enzime potrebne za njegovu sintezu (Stoffel-Wagner, 2001.; Reddy, 2010.). Treće, poznato je da je neuroprotektivni učinak estradiola povezan s njegovim antioksidativnim (Behl i sur., 1997.) i antiapoptotskim (Asimiadou i sur., 2005.) učincima, odnosno s učincima suprotnim učincima Abeta peptida.

Dobiveni rezultati mogu ukazivati ​​na adaptivnu reakciju živčanog tkiva na uvođenje toksičnog peptida. Neke publikacije pokazuju da bi sustav lizosomalne autofagije mogao biti uključen u razgradnju beta-amiloidnog peptida (Nixon, 2007.). Vjerojatno je da estradiol stimulira autofagiju proteinskog materijala; O tome svjedoče i podaci o sadržaju Abeta peptida u moždanom tkivu i procjena aktivnosti i razine ekspresije lizosomskih proteinaza. Fluorescentna imunohistokemija otkrila je smanjenje količine beta peptida u štakora koji su primali neuroprotektivnu terapiju estradiolom.

Na temelju podataka dobivenih u eksperimentu mogu se izvući sljedeći zaključci. 1. Razina ekspresije gena lizosomalnih proteinaza CtsD, CtsB, CtsL i alfa podjedinica proteasoma te aktivnost enzima koje kodiraju u moždanoj kori štakora opada sa starenjem. Naprotiv, povećava se aktivnost kalpaina kod životinja starijih dobnih skupina. 2. Razina ekspresije i aktivnosti katepsina D, kao i intenzitet proteolize ovisne o kalciju, značajno se povećava u hipokampusu i cerebralnom korteksu štakora nakon intracerebralne primjene beta-amiloidnog peptida, a kognitivna funkcija životinja trpi. . 3. Primjena estradiola na pozadini intoksikacije beta-amiloidom dovodi do smanjenja sadržaja ovog peptida u hipokampusu štakora i poboljšanja biokemijskih i bihevioralnih pokazatelja u pokusnih životinja. 4. Farmakološka aktivacija lizosomske funkcije pomoću estrogena može pospješiti uklanjanje Abeta u Alzheimerovoj bolesti; normalizacija homeostaze kalcija u ovoj situaciji sprječava patološku aktivaciju kalpainskog sustava i, u isto vrijeme, gubitak neurona duž putova stanične smrti ovisnih o kalpainu.

U praksi laboratorijske dijagnostike zaraznih bolesti ponekad postoji potreba za određivanjem protutijela ne na uzročnika općenito, već na određene njegove proteine ​​(antigene), odnosno spektar specifičnih protutijela. Ako se u tu svrhu koristi metoda enzimskog imunoanalize, tada je u ovom slučaju potrebno najprije izolirati i pročistiti potrebne antigene iz kulture patogena. Dobiveni proteini se odvojeno nanose na čvrstu fazu. U slučaju korištenja ploče s 96 jažica, u svaku jažicu stavlja se jedna vrsta antigena. Zatim se neizravnom metodom određuju specifična protutijela.

Prisutnošću pozitivne reakcije u jažici s određenim antigenom može se suditi o prisutnosti odgovarajućih specifičnih protutijela. Ove vrste imunoenzimskih testnih sustava nude proizvodne tvrtke, no metoda imunoblotinga (Western blot) postala je raširena zbog veće informativnosti i jednostavnosti izvođenja samog testa.

Imunološki bloting omogućuje određivanje protutijela u krvnom serumu istodobno i istovremeno diferencirano na sve dijagnostički značajne proteine ​​uzročnika. Prijevod s engleskog Western blot znači zapadni prijenos (doslovno - upijanje). Povijest ovog neobičnog pojma je sljedeća.

Godine 1975., znanstvenik po imenu E. Southern prvi je predložio metodu za prijenos elektroforetski odvojenih fragmenata DNK iz gela na membranu. Prema autoru, metoda je nazvana Southern blot, što u prijevodu znači “južni transfer”. Metoda prijenosa RNA molekula stručnjaci su pak prozvali Northern blot - "sjeverni prijenos". Prvo u šali, a onda se ovaj naziv ustalio u službenoj znanstvenoj literaturi.

Godine 1979. G. Towbin objavio je rezultate prvih pokusa proteinskog upijanja. U nastavku tradicije "zemljopisnih" naziva za metode prijenosa bioloških makromolekula, ova se metoda počela nazivati ​​"Western" prijenos - Western blot.

Prvi korak ove metode uključuje elektroforetsko odvajanje mješavine proteina patogena u poliakrilamidnom gelu u prisutnosti natrijevog dodecil sulfata (SDS). SDS, kao surfaktant, ravnomjerno obavija proteinske molekule i daje im svima negativan naboj približno jednake veličine. Dakle, molekule se gibaju u električnom polju u jednom smjeru, a brzina gibanja ovisi samo o veličini molekule (molekulskoj masi) proteina.

Kao rezultat elektroforetskog postupka dobiva se gel ploča u čijoj se debljini proteini nalaze u obliku zasebnih tankih linearnih zona. Prema smjeru kretanja dijele se sljedećim redoslijedom: proteini velike molekulske mase, oko 120-150 kDa, bliže su startu, a proteini mase 5-10 kDa najdalje su odmakli do cilja. crta. U drugoj fazi, gel ploča se postavlja na ploču nitroceluloze i ta se struktura postavlja između elektroda izvora istosmjerne struje. Pod utjecajem električnog polja proteini teku iz poroznog gela u gušću membranu, gdje se čvrsto fiksiraju.

Dobivena mrlja se tretira otopinom za blokiranje koja sadrži antigenski indiferentne proteine ​​i/ili neionske deterdžente (Tween 20), koji blokiraju mjesta na membrani bez antigena. List membrane se zatim reže na uske trake tako da svaka traka sadrži sve antigene frakcije. Opisane korake provodi proizvođač.

Komercijalni testni sustavi za otkrivanje antitijela korištenjem imunoblotinga sadrže mrlje (trake ili trake) koje su spremne za testiranje. Korisnik neizravnom metodom određuje cijeli spektar specifičnih protutijela na proteine ​​patogena. Topljiva bezbojna tvar koristi se kao kromogen za izvođenje obojene (enzimske) reakcije, čiji produkt dobiva boju, postaje netopljiv i taloži se (taloži) na nitrocelulozi.

Kao rezultat sekvencijalnih imunoloških i enzimskih reakcija, u prisutnosti protutijela na proteine ​​patogena u ispitivanom uzorku, na mrlji se pojavljuju tamne poprečne pruge čije je mjesto u zoni određenih proteina patogena. Svaka takva traka ukazuje na prisutnost specifičnih protutijela na odgovarajući antigen. Rezultat studije provedene imunoblotingom daje se u obliku popisa antitijela na specifične proteine ​​patogena. Na primjer: "otkrivena su antitijela na proteine ​​p17 i p24."

Nitrocelulozne mrlje mogu se pohraniti osušene dugo vremena nakon razvoja. Međutim, intenzitet boje značajno slabi. Mokre mrlje mogu se fotografirati ili se njihove grafičke slike mogu unijeti u memoriju osobnih računala pomoću skenera. Posebni računalni programi omogućuju vam obradu rezultata i brzo praćenje dinamike spektra protutijela tijekom dinamičkog promatranja

Western blotting je metoda kojom se traže specifična protutijela protiv bakterija koje uzrokuju lajmsku bolest. Što je Western blot test? Kako protumačiti rezultate studije?

Western blotting je test koji traži antitijela koja tijelo stvara protiv bakterije koja uzrokuje lajmsku bolest. Na površini bakterija nalaze se antigeni protiv kojih tijelo ima specifična antitijela u razredu IgM i IgG. IgM.

Imunoglobulin M (IgM) - proizvodi se kada se naše tijelo prvi put susreće s određenim patogenom. Povećanje količine IgM protiv određenog patogena ukazuje na početak procesa bolesti.

Imunoglobulin G (IgG) tijelo proizvodi nakon IgM, najvišu razinu postiže oko šest mjeseci nakon infekcije, a za razliku od IgM, antitijela mogu ostati u krvi jako dugo, čak i nekoliko godina.

Western Blot test - indikacije za izvođenje

Western blot se koristi u drugom stadiju dijagnosticiranja borelioze - kada ELISA test (prvi test) daje pozitivan ili dvosmislen rezultat. Međutim, ne koristi se kada je ELISA test jasno negativan.

Western blotting - što je test?

Western Blot test za boreliozu (Lyme bolest) točno procjenjuje antitijela na različite fragmente bakterija. Razna antitijela
protiv pojedinačnih bakterijskih fragmenata grafički se odražavaju kao crne pruge na nitroceluloznom papiru.

1. Za provođenje testa potrebna su dva glavna elementa: pacijentov krvni serum i ubijene i fragmentirane uzgojene bakterije borelioze.

Ne radite ovaj test ubrzo nakon uboda krpelja. Pričekajte najmanje 4 tjedna. Trošak Western Blotting studije u obje klase antitijela je oko 2500-5000 rubalja.

2. Pod utjecajem električne struje dolazi do raspodjele na čimbenike, prvenstveno bakterije dobivene iz stanične kulture, uključujući bakterijske proteine ​​(antigene). Ti se proteini zatim prenose na nitroceluloznu membranu. Membrana se reže na trake.

3. Antigenska traka, u kombinaciji s pacijentovim krvnim serumom, boji se posebnom tehnikom koja detektira antitijela specifično povezana s antigenima Sprechete Borrelia.

4. Na mjestima gdje su bolesnikova antitijela vezana za proteine ​​(antigene) bakterije borelioze uočavamo karakteristične pruge (indikacija infekcije Lyme bakterijom). Rezultat testa je pozitivan.

Svaka traka odgovara bakterijskom proteinu (antigenu). Ako se proteini stanica Borelioze i antitijela ne spoje, traka se neće pojaviti. Tada je rezultat negativan.

Western Blot test – kada ga treba učiniti?

Rana dijagnoza lajmske bolesti je problematična zbog tzv. serološkog prozora. To je razdoblje od početka infekcije do početka proizvodnje antitijela koja se mogu otkriti. Za lajmsku bolest serološki prozor traje prosječno 4 tjedna.

Provođenje testova manje od 4 tjedna nakon uboda krpelja predstavlja rizik od dobivanja lažno negativnog rezultata.

Western Blot test - pozitivan rezultat

Imati antitijela protiv borelije znači da imate lajmsku bolest. Međutim, teško je odgovoriti na pitanje je li infekcija aktivna ili ne.

IgG protutijela nastala kao posljedica infekcije mogu se otkriti u krvi i 10, a ponekad i 20 godina nakon dijagnoze lajmske bolesti.

Također se događa da otkrivena IgM protutijela (koja se obično smatraju aktivnim markerom infekcije) mogu biti postojana i također ne ukazuju na aktivnu infekciju.

Western Blot test - negativan rezultat

Test može dati negativan rezultat u početnom razdoblju bolesti, tj. U prvih nekoliko tjedana nakon ugriza.

Western blot testiranje može se provesti ne samo ako se sumnja na Lyme, već i ako postoji infekcija H. pylori (koja uzrokuje peptički ulkus) ili HIV.

Western blot test može dati lažno negativan rezultat i u drugoj situaciji - kada je kod stare kronične borelioze zaustavljeno stvaranje antitijela ili kada su antitijela potpuno potrošena u borbi protiv ove bolesti.

Ako je sumnja na lajmsku bolest jaka, Western Blot test treba ponoviti nekoliko puta, na primjer, svakih nekoliko tjedana, kako bi se došlo do točke u kojoj su antitijela prisutna u krvi.

Prisutnost protutijela u aktivnoj lajmskoj bolesti varira, a osoba čiji je test negativan ima šanse biti pozitivan na ponovnom testiranju nekoliko tjedana kasnije. Ponekad se dijagnoza potvrdi tek nakon četvrtog ili petog puta.

U tom slučaju neki liječnici pokušavaju na drugačiji način doći do potvrde infekcije: pacijenta liječe antibioticima nekoliko tjedana, a nakon 5-6 tjedana šalju ga na Western blotting.

Liječenje antibioticima ovoliko vremena neće izliječiti kroničnu bolest, ali će promijeniti imunološki sustav dovoljno da u krvi bude dovoljno antitijela da se otkriju. Rezultat Western blot testa mora tumačiti liječnik specijaliziran za liječenje lajmske bolesti

WB test se može napraviti i tijekom antibakterijske terapije, no kod antibiotika je vjerojatnost pozitivnog rezultata nešto manja. Ovim testom bolest je najlakše dijagnosticirati 6 tjedana nakon prestanka antibiotske terapije.

Važno

Tumačenje studija je tumačenje bendova. Kao opće pravilo, treba pretpostaviti da je dijagnoza pouzdanija što je više traka. Tri pruge su stvarno veliko povjerenje, a 5-6 pruga znači lajmsku bolest s gotovo 100% vjerojatnošću.

Vrpce IgM imaju veću dijagnostičku vrijednost jer upućuju na aktivnu fazu krpeljne borelioze, iako otkrivena protutijela u klasi IgM (Vrpce IgM) mogu biti perzistentna i ne ukazuju na aktivnu infekciju. Ispada da je IgM visok na početku infekcije i, suprotno logici, kod kronične lajmske bolesti.

Povišene razine IgG protutijela mogu se smatrati rezidualnom infekcijom ili mogu ukazivati ​​na kroničnu aktivnu bolest.

Čak i negativan rezultat testa ne znači da Lajmska bolest nije prisutna. Negativan rezultat testa samo znači da u krvi nema antitijela protiv bakterija borelioze – to se može dogoditi, primjerice, kada je bakterija ušla u tijelo, a proizvodnja antitijela još nije počela (liječnici to razdoblje nazivaju serološki prozor).

Zbog raznolikosti metoda korištenih za provođenje ove studije, teško je dati univerzalne preporuke u vezi s tumačenjem. Svaki laboratorij koristi vlastite kriterije.

Bolest može otkriti samo liječnik specijalist na temelju simptoma i rezultata laboratorijskih pretraga. Wester Blot test ne može se tumačiti bez uzimanja u obzir simptoma.